ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם
Summary
Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.
Abstract
סרטן הערמונית הוא הצורה המובילה של גידולים ממאירים בקרב גברים בארצות הברית בזמן ניתוח טומן בחובו סיכון משמעותי של חוסר אונים וחוסר שליטה, מסורתיים כימותרפיות גישות היו במידה רבה, לא הצליחו. טיפול הורמונלי הוא יעיל בשלב מוקדם, אבל לעתים קרובות לא מצליח עם ההתפתחות העתידית של גידולי הורמון עקשן. אנחנו כבר מתעניין בפיתוח תרופות למיקוד חסר מטבולי מסוימים של תאים סרטניים. לאחרונה הראינו כי תאים סרטניים בערמונית במיוחד חסרי אנזים (synthase argininosuccinate, או ASS) המעורבים בסינתזה של חומצת אמינו ארגינין 1. מצב זה גורם לתאים הסרטניים להיות תלוי בארגינין אקסוגני, והם עוברים לחץ מטבולי כאשר ארגינין החופשי תיגמר ידי ארגינין deiminase (ADI) 1,10. ואכן, יש לנו הראינו כי תאי ערמונית סרטניים אנושיים CWR22 RV1 נהרגים ביעילות על ידי עדי באפופטוזיס caspase-עצמאי וautopha האגרסיביGY (או macroautophagy) 1,2,3. Autophagy היא תהליך שימור אבולוציונית-המאפשר לתאים כדי לעכל חלבונים לא רצויים על ידי התמוטטות lysosomal במהלך רעב תזונתי 4,5. למרות המרכיבים החיוניים של מסלול זה הם מאופיינים היטב 6,7,8,9, היבטים רבים של המנגנון המולקולרי עדיין אינם ברורים – בפרט, מהו תפקידיו של autophagy במותו בתגובה של תאי סרטן ערמונית לאחר טיפול ADI ? על מנת לענות על שאלה זו, אנו נדרשים שיטת ניסוי כדי למדוד את הרמה וההיקף של תגובת autophagic בתאים – ומכיוון שאין סמנים מולקולריים ידועים במדויק יכול לעקוב אחר תהליך זה, בחרנו לפתח גישה מבוססת הדמיה, באמצעות מיקרוסקופיה 11,12. הקרינה 3D כמותית
שימוש בתאים CWR22Rv1 במיוחד שכותרתו עם בדיקות ניאון לautophagosomes וlysosomes, אנו מראים כי ערימות תמונת 3D רכשו עם או wiמיקרוסקופיה deconvolution defield (ומאוחר יותר, עם סופר רזולוציה, מיקרוסקופיה מובנה תאורה) יכולה ללכוד באופן ברור בשלבים הראשונים של האינדוקציה autophagy. עם יישומי ניתוח תמונה דיגיטליים זמינים מסחרי, אנחנו יכולים בקלות להשיג מידע סטטיסטי על מספר autophagosome ויזוזום, גודל, הפצה, ומידה מסוימת של colocalization מכל תא הדמיה. מידע זה מאפשר לנו לעקוב אחר ההתקדמות של autophagy בתאים חיים דווקא ומאפשר המשך החקירה שלנו לתוך התפקיד של autophagy בטיפול כימותרפי.
Protocol
Representative Results
Discussion
תוך ההתבוננות הישירה של תאים שכותרתו עם בדיקות ניאון נגד LC3 מקובל כשיטת סטנדרטית כדי לאשר תגובת autophagic 6, ההדמיה 3D הכמותי של אותה המערכת (כפי שעשינו) מספק מידע ופירוט חסר תקדים על התהליך המורכב של הסלולר autophagy . בפרט, אנו צופים כי מאות (אם לא אלפי) של autophagosomes בתאים חי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכת גרנט: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ קונג), NIH CA150197S1 (ע"א Changou), מרכז-0,120,999 PHY NSF Biophotonics מדע וטכנולוגיה (DL וולפסון, FYS צ'ואנג), DOD PC073420 (RJ מודגש), המחקר המועצה של נורבגיה, Leiv Eiriksson מסעות גרנט 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ קונג גם מכיר בתמיכת קרן אובורן קהילת סרטן הקרן. RJ מודגש גם מכיר את תמיכתה של מקדונלד 'ס י הקדש.
אנו מודים לד"ר ג'ני ויי-ג'ן קונג וד"ר בור ון וו בDesigneRx לאספקה נדיבה של עדי.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
