고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석
Summary
자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.
Abstract
수술은 발기 부전과 요실금의 중요한 위험을 수행하는 동안 전립선 암은 미국 남성들 사이 악성의 주요 형태이며, 기존의 화학 요법 방법은 대부분 실패했습니다. 호르몬 치료는 초기 단계에 효과적이지만, 종종 호르몬 불응 성 종양의 최종 개발에 실패합니다. 우리는 종양 세포의 특정 대사 결핍을 대상으로 치료제 개발에 관심이있다. 우리는 최근이 전립선 종양 세포는 특히 아미노산 아르기닌 (1)의 합성에 관여하는 효소 (argininosuccinate 합성 효소 또는 ASS)를 부족했다. 이 조건은 외생 아르기닌에 의존하는 종양 세포를 원인, 무료 아르기닌은 아르기닌 deiminase (ADI) 1,10가 고갈 될 때 신진 대사 스트레스를 겪는다. 사실, 우리는 인간의 전립선 암 세포 CWR22 RV1을 효과적으로 카스파 독립적 인 세포 사멸과 적극적인 autopha과 ADI에 의해 살해되는 것으로 나타났습니다GY (또는 macroautophagy) 1,2,3. 자식 작용은 세포가 4,5 영양 기아 동안 리소좀 고장에 의해 원치 않는 단백질을 대사 할 수 있도록 진화 – 보존 과정입니다. 이 통로의 필수 구성 요소가 6,7,8,9 잘 특성화되어 있지만, 분자 기계의 많은 부분은 여전히 불분명하다 – 특히 ADI의 치료 후 전립선 암 세포의 죽음 반응에 autophagy에의 역할을 무엇인가 ? 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포 자식 작용 반응의 수준과 범위를 측정하는 실험 방법을 필요 – 정확하게이 과정을 추적 할 수있는 알려진 분자 마커가 없기 때문에, 우리는 사용하여 영상 기반의 접근 방식을 개발하기로 결정했습니다 양적 3D 형광 현미경 11,12.
autophagosomes과 리소좀 형광 프로브를 구체적으로 표지 된 CWR22Rv1 세포를 사용하여, 우리는 3D 이미지 스택 위스콘신 중 하나에 인수 보여defield의 디컨 볼 루션 현미경 (이상, 최고 해상도, 구조적 조명 현미경)은 명확하게 autophagy에 유도의 초기 단계를 캡처 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 디지털 이미지 분석 응용 프로그램과 함께, 우리는 쉽게 autophagosome과 리소좀 수, 크기, 분포 및 이미지 한 셀에서 colocalization을 정도에 대한 통계 정보를 얻을 수 있습니다. 이 정보는 우리가 정확하게 살아있는 세포의 자식 작용의 진행 상황을 추적 할 수 및 암 화학 요법 autophagy에의 역할에 대한 지속적인 조사를 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
LC3에 대한 형광 프로브로 표시된 세포의 직접 관찰이 널리 자식 작용 반응 6, 양적 3D 동일한 시스템 (우리가했던 것처럼)의 영상 세포 자식 작용의 복잡한 과정에 대해 전례없는 정보와 세부 정보를 제공합니다 확인하는 표준 방법으로 인정되고 있지만 . 특히, 우리는 살아있는 세포에있는 autophagosomes의 수백 (수천하지 않을 경우) autophagy를 유도 80 분 내에 형성되는 것을 관찰합니다. 마찬?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
보조금 지원 : NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ 쿵), NIH CA150197S1 (CA Changou), 바이오 포토닉스 과학 & 기술 (DL 울프슨, FYS 추앙), DOD PC073420 (RJ 굵게)에 대한 NSF PHY-0120999 센터, 연구 노르웨이 의회, Leiv 에릭손 여행 그랜트 209286/F11 (BS Ahluwalia는). HJ 쿵푸는 오번 커뮤니티 암 기부 기금의 지원을 인정합니다. RJ 굵은는 J. 맥도날드 기부금의 지원을 인정합니다.
우리는 ADI의 관대 한 공급 박사 제니 웨이 – 젠 쿵푸와 DesigneRx 박사 보르 – 원자바오 우 감사합니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
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