Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi
Summary
Autophagy er en allestedsnærværende prosess som gjør det mulig for cellene å fornedre og resirkulere proteiner og organeller. Vi bruker avansert fluorescens mikroskop for å visualisere og kvantifisere den lille, men viktige, fysiske endringer knyttet til induksjon av autophagy, herunder dannelse og distribusjon av autophagosomes og lysosomer, og de blander inn autolysosomes.
Abstract
Prostatakreft er den ledende formen for kreftsykdom blant menn i USA Mens operasjoner innebærer en betydelig risiko for impotens og inkontinens, har tradisjonelle kjemoterapeutiske tilnærminger i stor grad vært mislykket. Hormonbehandling er effektiv på et tidlig stadium, men ofte mislykkes med eventuell utvikling av hormon-ildfaste svulster. Vi har vært interessert i å utvikle behandlingsformer rettet mot spesifikke metabolske mangel av kreftceller. Vi har nylig vist at prostata tumorceller spesifikt mangler et enzym (argininosuccinate syntase, eller ASS) som er involvert i syntesen av aminosyren arginin 1.. Denne tilstanden fører til at kreftceller til å bli avhengig av eksogene arginin, og de gjennomgår metabolsk stress når fri arginin er oppbrukt av arginin deiminase (ADI) 1,10. Vi har faktisk vist at menneskelige prostata kreft celler CWR22 RV1 er effektivt drept av ADI med kaspase-uavhengig apoptose og aggressiv autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy er et evolusjonært bevart prosess som gjør at cellene til å forbrenne uønskede proteiner ved lysosomale sammenbrudd under ernæringsmessige sult 4,5. Selv om de grunnleggende komponentene i denne veien er godt karakterisert 6,7,8,9, mange aspekter av den molekylære mekanismen er fortsatt uklart – spesielt hva er rollen til autophagy i døden respons av prostata kreft celler etter ADI behandling ? For å løse dette spørsmålet, må vi en eksperimentell metode for å måle nivået og omfanget av autophagic respons i celler – og siden det er ingen kjente molekylære markører som kan nøyaktig spore denne prosessen, valgte vi å utvikle en avbildning tilnærming, ved hjelp kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12.
Ved hjelp CWR22Rv1 celler spesifikt-merket med fluorescerende prober for autophagosomes og lysosomer, viser vi at 3D bildestakker kjøpt med enten widefield deconvolution mikroskopi (og senere, med super-oppløsning, strukturert-belysning mikroskopi) kan tydelig fange de tidlige stadiene av autophagy induksjon. Med kommersielt tilgjengelige digitale bildeanalyse applikasjoner, kan vi lett få statistisk informasjon om autophagosome og lysosome antall, størrelse, distribusjon, og graden av colocalization fra noen avbildes celle. Denne informasjonen gir oss mulighet til nettopp spore fremdriften av autophagy i levende celler og gjør vår fortsatte etterforskning i rollen som autophagy i kreft kjemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens direkte observasjon av celler merket med fluorescerende prober mot LC3 er allment akseptert som en standard metode for å bekrefte autophagic respons 6, kvantitative 3D avbildning av det samme systemet (som vi har gjort) gir enestående informasjon og detaljer om den komplekse prosessen med mobilnettet autophagy . Spesielt ser vi at hundrevis (om ikke tusenvis) av autophagosomes i levende celler dannes innenfor 80 min av autophagy induksjon. Tilsvarende ser vi svært interessante morfologiske endringer i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant støtte: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Center for Biophotonics Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Fet), Forskningsrådet Råd Norge, Leiv Eiriksson reisestipend 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkjenner også støtte fra Auburn Fellesskapet Cancer Endowment Fund. RJ Fet erkjenner også støtte av J. McDonald begavelse.
Vi takker Dr. Jenny Wei-Jen Kung og Dr. Bor-wen Wu på DesigneRx for sjenerøs tilførsel av ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
