Количественный анализ Аутофагия использованием Advanced 3D флуоресцентной микроскопии
Summary
Аутофагия вездесущий процесс, который позволяет клеткам деградировать и переработку белков и органелл. Мы применяем передовые флуоресцентной микроскопии для визуализации и количественной небольшой, но существенный, физические изменения, связанные с индукцией аутофагии, в том числе формирование и распределение аутофагосом и лизосом, и их слияние в autolysosomes.
Abstract
Рак предстательной железы является ведущей формой злокачественных новообразований среди мужчин в США, а операция несет в себе существенный риск импотенция и недержание мочи, традиционные химиотерапевтические подходы были в значительной степени неудачны. Гормональная терапия является эффективным на ранней стадии, но часто не с возможным развитием гормонорефрактерный опухолей. Мы были заинтересованы в разработке терапии, ориентированные на конкретные метаболические дефицита опухолевых клеток. Недавно мы показали, что клетки опухоли простаты в частности отсутствие фермента (argininosuccinate синтазы или АСС), участвующих в синтезе аминокислоты аргинина 1. Это состояние приводит к опухолевым клеткам, чтобы стать зависимыми от экзогенных аргинин, и они подвергаются метаболическому стрессу, когда свободного аргинина исчерпывается аргинин deiminase (ДСП) 1,10. Действительно, мы показали, что человеческие клетки рака простаты CWR22 Rv1 эффективно убит ADI с каспазы-независимого апоптоза и агрессивных autophaГр (или макроаутофагии) 1,2,3. Аутофагия эволюционно-консервативный процесс, который позволяет клеткам усваивать нежелательных белков лизосомальными пробоя при питании 4,5 голода. Хотя основные компоненты этого пути хорошо характеризуется 6,7,8,9, многие аспекты молекулярного механизма до сих пор неясны – в частности, какова роль аутофагии в смерти-ответ клеток рака простаты после лечения ADI ? Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы потребовали экспериментального метода для измерения уровня и степени аутофагической ответа в клетках – и так как нет никаких известных молекулярных маркеров, которые могут точно отслеживать этот процесс, мы решили развивать изображений подход, используя количественной флуоресцентной микроскопии 3D 11,12.
Использование CWR22Rv1 клеток, специфически-меченных флуоресцентными зондами для аутофагосомы и лизосом, мы показываем, что 3D-изображение, полученное стеки либо с Widefield деконволюцией микроскопии (а позднее, с супер-разрешения, структурированное освещения микроскопия) может четко захватить на ранних стадиях аутофагию индукции. С помощью коммерчески доступных цифровых приложений анализа изображений, мы можем легко получить статистическую информацию о аутофагосом лизосом и количество, размер, распределение и степень колокализации из любого отображаемого клетки. Эта информация позволяет нам точно отслеживать прогресс аутофагию в живых клетках и позволяет нашим продолжение расследования роли аутофагию в химиотерапии рака.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как непосредственное наблюдение клетки помечены флуоресцентными зондами против LC3 широко применяется в качестве стандартного метода для подтверждения аутофагической ответ 6, количественные изображения в 3D и той же системе (как мы сделали) обеспечивает беспрецедентну…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Грантовая поддержка: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Биофотоники Центр Науки и Технологии (DL Wolfson, FYS Чжуан), DOD PC073420 (RJ Жирный), Научно-исследовательский Совет Норвегии, Leiv Eiriksson грант 209286/F11 (BS Ахлувалия). HJ Кунг также благодарит за поддержку Рыжий Общественный фонд рака фонда. RJ Жирный также благодарит за поддержку J. McDonald одаренность.
Мы благодарим доктора Дженни Вэй-Jen Кунг-и д-р Бор-на Вэнь У DesigneRx на щедрые поставки ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
