Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi
Summary
Autophagy är en allestädes närvarande process som gör det möjligt för celler att brytas ned och återvinna proteiner och organeller. Vi tillämpar avancerad fluorescens mikroskopi för att visualisera och kvantifiera små, men viktiga, fysiska förändringar i samband med framkallande av autophagy, däribland bildandet och distribution av autophagosomes och lysosomer, och deras fusion i autolysosomes.
Abstract
Prostatacancer är den ledande formen av maligniteter bland män i USA Medan operation medför en betydande risk för impotens och inkontinens, har traditionella kemoterapeutiska metoder tappat målet. Hormonbehandling är effektiv på tidigt stadium, men ofta misslyckas med en eventuell utveckling av hormonrefraktär tumörer. Vi har varit intresserade av att utveckla läkemedel som riktar sig specifikt metabolisk brist på tumörceller. Vi visade nyligen att prostatatumörceller specifikt saknar ett enzym (argininosuccinat syntas eller ASS) involverade i syntesen av aminosyran arginin 1. Detta tillstånd orsakar tumörcellerna att bli beroende av exogen arginin, och de genomgår metabolisk stress då fri arginin är uttömda av arginindeiminas (ADI) 1,10. Vi har faktiskt visat att humana prostatacancerceller CWR22 RV1 effektivt dödas av ADI med kaspas-oberoende apoptos och aggressiv autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy är en evolutionärt bevarad process som gör att celler att metabolisera oönskade proteiner genom lysosomal nedbrytning under näringsmässiga svält 4,5. Även de viktigaste komponenterna i denna väg är väl karaktäriserade 6,7,8,9, många aspekter av den molekylära mekanismen är fortfarande oklar – i synnerhet, vad är rollen av autophagy i döden-respons av prostatacancerceller efter ADI behandling ? För att ta itu med denna fråga, krävs vi en experimentell metod för att mäta nivån och omfattningen av autophagic respons i celler – och eftersom det inte finns några kända molekylära markörer som exakt kan spåra denna process, valde vi att utveckla en avbildning synsätt, med kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12.
Använda CWR22Rv1 celler specifikt märkta med fluorescerande prober för autophagosomes och lysosomer, visar vi att 3D bildstaplar förvärvats med antingen widefield deconvolution mikroskopi (och senare, med super-upplösning, strukturerad-belysning mikroskopi) kan tydligt fånga de tidiga stadierna av autophagy induktion. Med kommersiellt tillgängliga digitala applikationer bildanalys, kan vi få lätt statistisk information om autophagosome och lysosome antal, storlek, fördelning, och graden av colocalization från någon avbildade cell. Denna information ger oss möjlighet att exakt följa utvecklingen av autophagy i levande celler och möjliggör vår fortsatta utredning in i rollen av autophagy i cancer kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan den direkta observationen av celler märkta med fluorescerande prober mot LC3 är allmänt accepterat som en standardmetod för att bekräfta autophagic svar 6, kvantitativ 3D avbildning av samma system (som vi har gjort) ger oöverträffad information och detaljer om den komplexa processen av cellulära autophagy . Framför allt märker vi att hundratals (om inte tusentals) av autophagosomes i levande celler bildas inom 80 min av autophagy induktion. Likaså ser vi mycket intressanta morfologiska för?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant stöd: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Centrum för Biophotonics Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ fet), The Research Norges, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkänner också stöd från Auburn Community Cancer Donationsfond. RJ Bold erkänner också stöd av J. McDonald kapitalförsäkring.
Vi tackar Dr Jenny Wei-Jen Kung och Dr Bor-wen Wu vid DesigneRx för generöst utbud av ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
