Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz
Summary
Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.
Abstract
Cerrahi iktidarsızlık ve inkontinans önemli bir risk taşır iken Prostat kanseri ABD'de erkekler arasında malignite önde gelen biçimidir, geleneksel kemoterapötik yaklaşımların büyük ölçüde başarısız olmuştur. Hormon tedavisi erken bir aşamada etkilidir, ancak genellikle hormon dirençli tümörlerin nihai gelişimi ile başarısız olur. Biz tümör hücrelerinin belirli metabolik eksikliği hedefleyen tedavi gelişmekte ilgi var. Yakın zamanda bu prostat tümör hücrelerinin, özellikle amino asit arginin 1 sentezinde yer alan bir enzim (argininosükinat sintaz veya ASS) eksikliği göstermiştir. Bu durum dışsal arjinin bağımlı hale için tümör hücrelerinin neden olur, ve ücretsiz arjinin arjinin deiminaz (ADI) 1,10 ile bittiği zaman metabolik stres tabi. Gerçekten de, insan prostat kanseri hücrelerinde CWR22 RV1 etkili kaspaz-bağımsız apoptoz ve agresif autopha ile ADI tarafından öldürüldü olduğunu göstermiştirgy (veya macroautophagy) 1,2,3. Otofaji hücreleri 4,5 beslenme açlık sırasında lizozomal arıza istenmeyen proteinleri metabolize sağlayan bir evrimsel-korunmuş bir süreçtir. Bu yolun temel bileşenleri 6,7,8,9 iyi karakterize olmasına rağmen, moleküler mekanizmasının birçok açıdan hala belirsiz – özellikle, ADI tedavi sonrası prostat kanseri hücrelerinin ölümüne-yanıt olarak otofaji rolü nedir ? Bu soruya cevap verebilmek için, biz hücrelerinde otofajik cevap düzeyi ve kapsamı ölçmek için deneysel bir yöntem gerekli – ve doğru bu süreci takip edebilirsiniz bilinen bir moleküler işaretleri olduğu için, biz kullanarak, bir görüntüleme-temelli bir yaklaşım geliştirmek için seçti nicel 3D floresan mikroskobu 11,12.
Autophagosomes ve lizozomlar için floresan problar ile özel etiketli CWR22Rv1 hücreleri kullanarak, 3D görüntü yığınlarının wi ya ile elde olduğunu göstermektedirdefield deconvolution mikroskobu (ve daha sonra, süper çözünürlük, yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu ile) açıkça otofaji indüksiyon erken aşamalarında yakalayabilir. Piyasada bulunan dijital görüntü analizi uygulamaları ile, kolayca autophagosome ve lizozom sayısı, boyutu, dağılımı ve herhangi bir görüntülü hücreden ko derecesi hakkında istatistiksel bilgi alabilirsiniz. Bu bilgiler tam olarak canlı hücrelerin içinde otofaji ilerleme izlemenize olanak sağlayan ve kanser kemoterapi otofaji rolüne devam eden soruşturma sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
LC3 karşı floresan problar ile işaretli hücrelerin doğrudan gözlem yaygın otofajik yanıt 6, nicel 3D aynı sistem (yaptığımız gibi) görüntüleme hücresel otofaji karmaşık süreci hakkında benzeri görülmemiş bir bilgi ve ayrıntı sağlayan onaylamak için standart bir yöntem olarak kabul edilirken . Özellikle, canlı hücrelerde autophagosomes yüzlerce (yoksa bin) otofaji indüksiyon 80 dakika içinde oluşur görüyoruz. Benzer şekilde, otofaji indüksiyon sırasında lizozomal bölm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hibe desteği: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), Biophotonics Bilim ve Teknoloji (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Kalın) için NSF FİZ-0.120.999 Merkezi, Araştırma Norveç Konseyi, Leiv Eiriksson Seyahat Bursu 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung de Auburn Topluluk Kanser Vakfı Fonu'nun desteğiyle kabul eder. RJ Kalın da J. McDonald bağış desteği kabul eder.
Biz ADI cömert temini için Dr Jenny Wei-Jen Kung ve DesigneRx Dr Bor-wen Wu teşekkür ederim.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
