Super-opløsning Imaging af Bakteriel Division Machinery

Summary

Vi beskriver en super-opløsning billeddannelse metoden til undersøgelse af den strukturelle organisation af det bakterielle FtsZ-ring, en væsentlig apparat til celledeling. Denne metode er baseret på kvantitative analyser af fotoaktiverede lokalisering mikroskopi (PALM) billeder og kan anvendes på andre bakterielle cytoskeletproteiner.

Abstract

Bakteriel celledeling kræver den koordinerede samling af mere end ti essentielle proteiner ved midcell ^1,2. Centralt for denne proces er dannelsen af en ringlignende suprastructure (Z-ring) af FtsZ proteinet ved opdelingsplaner ^3,4. Z-ring består af multiple enkeltstrengede FtsZ protofilamenter, og forståelse af arrangementet af protofilamenter inde i Z-ringen, vil give indsigt i mekanismen for Z-ringsamlingen og dets funktion som force generator ^5,6. Denne information er forblevet undvigende grund af de nuværende begrænsninger i konventionelle fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi. Konventionel fluorescens-mikroskopi er i stand til at tilvejebringe et billede med høj opløsning af Z-ring på grund af diffraktion grænsen af ​​lys (~ 200 nm). Electron cryotomographic billeddannelse har registreret spredt FtsZ protofilamenter i små C. crescentus celler ^7, men er vanskelig at anvende til større celler, såsomE. coli eller B. subtilis. Her beskriver vi anvendelsen af en super-opløsning fluorescensmikroskopi metode, til fotoaktiveret Localization Microscopy (PALM), kvantitativt karakterisere den strukturelle organisering af E. coli Z-ring ^8.

PALM billedbehandling tilbyder både høj rumlig opløsning (~ 35 nm) og særlig mærkning for at muliggøre entydig identifikation af target-proteiner. Vi mærkede FtsZ med den fotoaktiverbare fluorescerende protein mEos2, som skifter fra grøn fluorescens (excitation = 488 nm) til rød fluorescens (excitation = 561 nm) efter aktivering ved 405 nm ^9. Under en PALM eksperiment, er enlige FtsZ-mEos2 molekyler stokastisk aktiveret og de tilsvarende centroid positioner af de enkelte molekyler bestemmes med <20 nm præcision. En super-opløsning billede af Z-ringen bliver så rekonstrueret ved at sammenføje det geometriske tyngdepunkt positioner for alle detekterede FtsZ-mEos2 molekyler.

<p class = "jove_content"> anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi fundet, at Z-ringen har en fast bredde på ~ 100 nm og består af en løs bundt FtsZ protofilamenter der overlapper hinanden i tre dimensioner. Disse data giver et afsæt til yderligere undersøgelser af cellecyklus afhængige ændringer i Z-ringen ¹⁰ og kan anvendes på andre proteiner af interesse.

Protocol

1. Prøvefremstilling Inokulere LB-medier med en enkelt koloni af stammen JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Vokse natten over på et rysteapparat ved 37 ° C. Fortynd kulturen 1:1000 i M9 + minimale medier [M9-salte, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM aminosyrer og vitaminer] og vokser til mid-log fase (OD600 = 0,2 til 0,3) i nærværelse af chloramphenicol (150 ug / ml) ved stuetemperatur (RT). Fremkald kultur med…

Representative Results

Vist i fig 3Aiv er et todimensionalt, super opløsning præstationen af Z-ringen dannet fra PALM imaging beskrevet ovenfor. Nedenfor har vi opsummere kvalitative og kvantitative oplysninger, der kan opnås fra dem. Kvalitativt vi observeret, at Z-ringen er en uregelmæssig struktur, der anvender multiple konfigurationer (enkelt bånd eller spiralformede bue), der ikke kan skelnes i konventionelle fluorescensbilleder (sammenlign figur 3A-Dii og iv).</…

Discussion

PALM billeder indeholder information om molekyle tæller og positioner inden for en celle, hvilket tillader detaljeret analyse af fordelingen og placeringen af ​​mål-proteinmolekyler, som er vanskeligt at opnå på anden måde. Nedenfor skitserer vi forholdsregler, der skal træffes for at udtrække præcis kvantitativ information og samtidig opretholde den biologiske relevans af PALM billeder. Vi har også udforske oplysninger, der kan bedst opnås ved anvendelse af levende vs faste celler. Endelig foreslår vi mu…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamins	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyde	Electron Micrsocopy Sciences	15710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Beads	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stage Adaptor	ASI	I-3017
Inverted Microscope	Olympus	IX71
1.45 NA, 60x Objective	Olympus
IXON EMCCD Camera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Coherent
561-nm Sapphire Laser	Coherent
405-nm CUBE Laser	Coherent