כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן
Summary
טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.
Abstract
מחלות כליה הקשורות אובדן שתן של מולקולות חיוניות גדולות, כגון אלבומין, כבר מזמן חשבתי להיגרם על ידי שינויים בחדירות המחסום מורכבים מpodocytes, תאי אנדותל כלי דם, וקרום במרתף עובד בהרמוניה. נתונים מהמעבדה שלנו באמצעות מיקרוסקופ 2 הפוטונים intravital חשפו מחסום חדיר יותר גלומרולרי סינון (GFB) מאשר סברו עד כה בתנאים פיסיולוגיים, עם ליפה של אלבומין המסונן המתרחש בקבוצת משנה מוקדמת של תאים הנקרא תאי אבובית הפרוקסימלית (PTC) 1,2, 3.
טכניקות קודמות שימש ללמוד סינון הכלייתי והקמה אופיינית למחסום הסינון המעורב micropuncture של לומן של המגזרים צינורי המוקדמים אלה עם דגימה של התוכן וניתוח 4 נוזל. מחקרים אלה קבעו ריכוז אלבומין בנוזל luminal להיות כמעט לא קיים; מקביל באופן הדוקלמה שבדרך כלל הוא זוהה בשתן. עם זאת, אפיון של הפולימרים dextran עם גדלים שהוגדרו על ידי טכניקה זו חשף אלה של גודל דומה לאלבומין בסרום היו רמות גבוהות יותר בלומן ושתן צינורי; מציע חדירות מוגברת 5.
מסמך זה הוא תיאור מפורט של הטכניקה המשמשת כדי להמחיש באופן ישיר ולכמת חדירות אלבומין ניאון גלומרולרי in vivo. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אלבומין מסונן על פני מחסום הסינון לתוך החלל של באומן (הקאמרית הראשוני של סינון שתן), וגם מאפשרת כימות של ספיגה חוזרת אלבומין על ידי צינוריות והדמיה של transcytosis 6 הבא אלבומין הפרוקסימלי. העדרו של ניאון אלבומין יחד מאוחרת מגזרים צינורי בדרך לשלפוחית השתן מדגיש את היעילות של המסלול אחזור במגזרים אבובית הפרוקסימלי קודם לכן. יתר על כן, כאשר טכניקה זו יושמה כדי לקבוע חדירותשל dextrans בעל גודל דומה לערכי חדירות כמעט זהים אלבומין דווח 2. תצפיות אלו תומכות ישירות בצורך להרחיב את הפוקוס של מחלות כליות proteinuric רבות לשינויים שנכללו בטיוב תא אבובית הפרוקסימלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעדים המודגשים כאן מייצגים את מה שאנחנו מרגישים להיות אלה שמייצרים ערכי חדירות עקביות ומדויקים משום שהם לעקוף את המלכודות הבאות:
- פיזור: השימוש בfluorophores פולטות אדום מאפשר גבייה יעילה יותר של אור מאז פוטונים באורך גל …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר סילביה B קמפוס, Bilderback וג'ורג' J רודוס להשלמת הליכים כירורגיים מעורבים מיקום של קווי גישה ורידים. הם גם רוצים להודות לשרה E לגמול לשמירה על מושבות מינכן-Wistar המורכבת משני זנים וFrömter סימונסן.
Materials
| Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
| Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
| Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
| Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
| Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
| Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
| High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
References
- Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
- Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).
- Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
- Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
- Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).
