Kwantificeren Glomerulaire Doorlatendheid Fluorescent macromoleculen Met 2-Photon Microscopy in München Wistarratten

Summary

Een techniek gebruik te maken van hoge resolutie intavital 2-foton microscopie om direct te visualiseren en te kwantificeren gloemrular filtratie in oppervlaktewater glomeruli. Deze methode maakt het mogelijk voor de directe bepaling van de permeabiliteit eigenschappen van macromoleculen in zowel normale en zieke staten.

Abstract

Nierziekten waarbij urine verlies van grote essentiële macromoleculen, zoals serumalbumine, hebben lange tijd gedacht te worden veroorzaakt door veranderingen in de permeabiliteit barrière bestaat uit podocytes, vasculaire endotheliale cellen, en een basaal membraan werken in koor. Gegevens van ons laboratorium met behulp intravitale 2-foton microscopie toonde een meer doorlaatbaar glomerulaire filtratie barrière (GFB) dan voorheen onder fysiologische omstandigheden gedacht, met het ophalen van gefilterde albumine die zich in een vroeg subset van cellen genoemd proximale tubulus cellen (PTC) ^{1,2, 3.}

Vorige technieken om renale filtratie bestuderen en de vaststelling van de kenmerken van filtratie barrière betrokken micropuncture het lumen van deze vroege buisvormige segmenten bemonstering van de vloeistofinhoud en analyse ^4. In deze onderzoeken albumine in de luminale vloeistof nagenoeg onbestaande, die nauw aansluitenwelke normaal in de urine. Echter, karakterisering van dextranpolymeren met gedefinieerde afmetingen van deze techniek bleek die van een soortgelijk formaat serumalbumine hadden hogere niveaus in het tubulaire lumen en urine; suggereert verhoogde doorlaatbaarheid ^5.

Hierin is een gedetailleerd overzicht van de gebruikte techniek om direct te visualiseren en te kwantificeren glomerulaire fluorescerende albumine permeabiliteit in vivo. Deze methode maakt het mogelijk voor de detectie van gefilterde albumine in de filtratie barrière in Bowman's ruimte (de eerste kamer van urine-filtratie), en maakt het ook mogelijk kwantificering van albumine reabsorptie door de proximale tubuli en visualisatie van de daaropvolgende albumine transcytose ^6. Het ontbreken van fluorescentie albumine later langs buisvormige segmenten op weg naar de blaas benadrukt de efficiëntie van het ophalen pathway in het oudere proximale tubulus segmenten. Bovendien, wanneer deze techniek werd toegepast op doorlatendheiddextranen met een vergelijkbare grootte aan albumine vrijwel identiek permeabiliteit gemeld ^2. Deze waarnemingen direct ondersteunen de noodzaak om de focus van veel proteïnurie nierziekten te breiden naar opgenomen veranderingen in proximale tubulus cel regeneratie.

Protocol

1. Vervoeging van Rat serum albumine te Sulfo-Rhodamine 101 sulfonylchloride (Texas Red) Los 100 mg Rat Serum Albumine (RSA) in 6,667 ml van 100 mM natriumbicarbonaat pH 9,0, uiteindelijke concentratie 15 mg / ml in een 50 ml conische buis. Plaats oplossing in ijs / water bekerglas en koel tot tussen 0 en 4 ° C. Voeg 200 ul van hoge kwaliteit watervrij Dimethylformamide (DMF) naar een 10 mg flacon van Texas Red sulfonylchloride (TRSC); vortex op medium voor 15 sec. Vortex RSA-op…

Representative Results

Figuur 3 toont een voorbeeld van een afbeelding uit een oppervlak van een glomerulus München Wistar Frömter rat en de maatregelen om de permeabiliteit van fluorescente albumine te bepalen. De SGR waarde voor albumine van 0,0111 afgeleid voor deze persoon glomerulus vallen binnen het bereik gezien bij deze stam van München Wistarratten toen in de gevoede toestand 3. De stabiliteit gezien in dergelijke beelden door de zorgvuldige planning en uitvoering van instructies getoond in figu…

Discussion

De stappen benadrukt hier vertegenwoordigen wat we voelen zijn degenen die zal produceren consistente en nauwkeurige permeabiliteitswaarden omdat ze omzeilen de volgende valkuilen:

1. Verstrooiing: Het gebruik van een rood emitterende fluoroforen zorgen voor een efficiëntere inning van het licht omdat fotonen langere golflengte minder geneigd zijn te verstrooien. Met behulp van hetzij groen of blauw emitterende fluoroforen zullen grotere variatie in de GSC's vanwege de verhoogde variabiliteit in intensite…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07