पूरे माउंट आरएनए प्रतिदीप्त<em> स्वस्थानी में</em> संकरण<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण
Summary
यहाँ हम एक पूरी माउंट फ्लोरोसेंट का वर्णन<em> स्वस्थानी में</em> RNAs की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण फल मक्खी में embryogenesis दौरान व्यक्त गुण का निर्धारण करने के लिए संकरण प्रोटोकॉल (मछली),<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em>.
Abstract
विकास के दौरान अपने जैविक समारोह को समझने के लिए एक जीन है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी लिखित शाही सेना के subcellular स्थानीयकरण गुण, की अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन प्रमुख विशेषताएं हैं. स्वस्थानी संकरण में शाही सेना (आरएनए-ish) एक शक्तिशाली शाही सेना वितरण गुणों visualizing के लिए विधि का इस्तेमाल किया है, यह जीवधारी, सेलुलर या subcellular 1 स्तर पर हो. शाही सेना ISH एक लेबल न्यूक्लिक एसिड (जैसे antisense शाही सेना, oligonucleotides) जांच एक mRNA या एक गैर कोडन 2 ब्याज की शाही सेना लक्ष्य के अनुक्रम के लिए पूरक के संकरण पर आधारित है. प्रक्रिया के रूप में प्राथमिक अनुक्रम जानकारी अकेले अनुक्रम विशेष जांच उत्पन्न करने की आवश्यकता है, यह सार्वभौमिक जीवों और ऊतक नमूनों 3 की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. दरअसल, बड़े पैमाने पर ISH अध्ययन के एक नंबर के लिए जीन की अभिव्यक्ति दस्तावेज और विभिन्न मॉडल जीवों में स्थानीयकरण गतिशीलता शाही सेना के लिए लागू किया गया है, जो करने के लिए नेतृत्व किया गया हैमहत्वपूर्ण समुदाय 4-11 संसाधनों की स्थापना. जबकि जांच लेबलिंग और पहचान की रणनीतियों की एक किस्म के वर्षों में विकसित किया है, fluorescently लेबल का पता लगाने अभिकर्मकों और enzymatic संकेत प्रवर्धन कदम का संयुक्त उपयोग संवेदनशीलता और 12 प्रक्रिया के संकल्प में महत्वपूर्ण वृद्धि की पेशकश करते हैं. यहाँ, हम स्वस्थानी संकरण (मछली) विधि tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) रोजगार के लिए शाही सेना और मंचन किया भ्रूण ड्रोसोफिला में अभिव्यक्ति स्थानीयकरण गतिशीलता कल्पना में एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट का वर्णन करता है. प्रक्रिया बाहर 96-अच्छी तरह से पीसीआर थाली प्रारूप है, जो बहुत से नमूनों की बड़ी संख्या के साथ – साथ प्रसंस्करण की सुविधा में किया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
जांच संश्लेषण कदम के लिए, हम आम तौर पर पूरी लंबाई ड्रोसोफिला ड्रोसोफिला जीन संग्रह (क्लब), निम्नलिखित वेबसाइट पर विस्तृत संसाधन में पाया प्लाज़मिड से amplified cDNAs से विट्रो प्रतिलेखन में रन दूर antisense…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम Lécuyer प्रयोगशाला में आयोजित राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग परिषद (NSERC), स्वास्थ्य (CIHR) अनुसंधान और Fonds डे Recherche एन Sante du क्यूबेक (FRSQ) की कनाडा के संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित है. Fabio एलेक्सिस Lefebvre और Moquin Beaudry Gaël NSERC स्नातक अनुसंधान studentships द्वारा समर्थित हैं, जबकि कैरोल Iampietro एंजेलो Pizzagalli postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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