Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Summary

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Abstract

Krebs-Immuntherapie bändigen können die Spezifität der Immunantwort zu zielen und zu beseitigen Tumoren. Adoptiven Zelltherapie (ACT), basierend auf den adoptiven Transfer von T-Zellen gentechnisch verändert, um ein chimäres Antigen-Rezeptor (CAR) ausdrücken hat beträchtliches Potential in klinischen Versuchen ^1-4 dargestellt. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung CAR ⁺ T-Zellen für die Behandlung von Krebsarten, einschließlich der Fähigkeit, nicht-MHC-beschränkte Antigene gezielt eingesetzt werden und die T-Zellen zur optimalen Überleben, Homing und Persistenz im Wirt zu funktionalisieren, und schließlich, um Apoptose zu induzieren von CAR ⁺ T-Zellen bei Wirtstoxizität ^5.

Abgrenzung der optimalen Funktionen des CAR ⁺ T-Zellen mit klinischen Nutzen zugeordnet ist von wesentlicher Bedeutung für die nächste Generation von klinischen Studien. Jüngste Fortschritte in der lebenden Tier Bildgebung wie Mehrphotonenmikroskopie revolutioniert haben die Studie von Immunzellen Funktion in ^6,7 vivo. Während diese Studien unser Verständnis der T-Zell-Funktionen in vivo T-Zell-basierte ACT in klinische Studien haben vorgeschoben erfordert die Notwendigkeit, die molekularen und funktionellen Eigenschaften der T-Zell-Zubereitungen Vorinfusionsleitung mit klinischen Wirksamkeit Nachinfusionsleitung verknüpfen, durch Verwendung in vitro-Assays überwacht T-Zell-Funktionen wie, Zytotoxizität und Zytokinsekretion. Standard Durchflusszytometrie basierende Assays entwickelt worden, bestimmen die allgemeine Funktionsweise von Populationen von T-Zellen in der Ebene einzelner Zellen, aber diese sind nicht geeignet für die Überwachung Konjugat Bildung und Leben oder die Fähigkeit der gleichen Zelle zu töten mehrere Ziele ^8.

Mikrohergestellte Arrays in biokompatible Polymere wie Polydimethylsiloxan (PDMS) ausgebildet sind ein besonders attraktives Verfahren zur räumlich beschränken Effektoren und Targets in kleinen Mengen ^9. In Kombination mit automatisierten Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, thousands von Effektor-Target-Wechselwirkungen können gleichzeitig durch bildgebende einzelnen Vertiefungen einer nanowell Arrays überwacht werden. Wir stellen hier eine Hochdurchsatz-Methodik zur Überwachung T-Zell-vermittelte Zytotoxizität bei der Einzelzell-Ebene, die weitgehend für die Untersuchung der Funktionalität von cytolytischen T-Zellen angewendet werden kann.

Protocol

Ein. Reagenzien Vorbereitung Planen RPMI-PLGH durch Mischen von 500 ml RPMI-1640 und jeweils 5 ml Penicillin-Streptomycin, L-Glutamin, und HEPES-Lösung. Planen R10 Lösung durch Mischen RPMI-PLGH mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Die FBS ist hitzeinaktiviertem bei 56 ° C für 30 min vor der Zugabe. Vorwärmen bei 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS und 15 ml R10 in sterilen konischen Rohren. Herstellung von Arrays von nanowells in PDMS: Das Silizium-Master hergestellt ist unte…

Representative Results

Ein Beispiel für die Anwendung des High-Throughput-Assays cytolytischen ist in Abbildung 2 gezeigt. Kurz gesagt, markierten CD19-spezifische CAR + T-Zellen wurden mit markierten Maus EL4-Zielzellen in den einzelnen Wells einer nanowell Array (Sektionen 1-5) coinkubiert. Ein erstes Bild wurde auf dem automatischen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, um die Belegung (Effektoren und / oder Targets) jedes einzelnen nanowell auf dem Array (Abschnitt 6) identifizieren. Bildverarbeitung wurde verwend…

Discussion

Wir haben das Protokoll für ein Hochdurchsatz-Single-Cell-Assay cytolytischen durch Co-Inkubation von Effektoren und Targets in Arrays von nanowells (Abbildung 1) aktiviert skizziert. Neben Durchsatz ein großer Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, Effektorzellen-vermittelten Zytotoxizität gegen gewünschten Zielzellen ohne Zielzelle Engineering Dies wiederum erlaubt die Verwendung von autologen oder Matched / primären Tumorzellen als Zielzellen zu überwachen. Die räumliche Begrenzung ermö…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell