נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר
Summary
שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.
Abstract
כל decellularization האיבר זלוף המבוסס צבר לאחרונה עניין בתחום הנדסת רקמות כאמצעי ליצור פיגומים תאיים מטריקס ספציפיים לאתר, תוך שמירה על מידה רבה את הארכיטקטורה המקורית של הפיגום. עד כה, גישה זו נוצלה במגוון רחב של מערכות איברים, כוללת לב, ריאות, הכבד ו1-5. שיטות decellularization קודמות לרקמות ללא רשת כלי דם נגישה הסתמכו על חשיפה ממושכת של רקמות לפתרונות של חומרי ניקוי, חומצות, או טיפולים אנזימטיים כאמצעי כדי להסיר את הרכיבים הסלולריים וגרעיניים מהסביבה התאית 6-8. עם זאת, היעילות של שיטות אלה תלויים על יכולתו של את הפתרונים לחלחל רקמות באמצעות דיפוזיה. לעומת זאת, טפטוף של איברים דרך מערכת כלי הדם הטבעית ביעילות מצמצם את מרחק דיפוזיה ותחבורת הנחייתם של decellularizatiעל סוכנים לרקמה והמרכיבים תאיים מהרקמות. בזאת, אנו מתארים שיטה לdecellularize לב חזירי שלם מלא דרך זלוף המדרדר כלילית. הפרוטוקול הניב decellularized מלוא לב תאי מטריצה (c-ECM) פיגום עם המבנה תלת הממדים של הלב השלם. השיטה שלנו השתמשה בסדרה של אנזימים, חומרי ניקוי, וחומצות בשילוב עם שטיפות hypertonic וhypotonic לסייע בתמוגה וההסרה של תאים. הפרוטוקול המשמש פתרון טריפסין לנתק את התאים מהמטריצה אחרי Triton פתרוני X-100 ונתרן deoxycholate כדי לסייע בהסרה של חומר תאי. הפרוטוקול המתואר משתמש גם במהירויות של יותר מ זלוף 2 ליטר / דקה לפרקי זמן ארוכים. קצב הזרימה הגבוהה, בשילוב עם שינויי פתרון נתן הובלה של סוכנים לרקמות ללא זיהום של פסולת תאית והבטיח יעיל שטיפה של הרקמות. השיטה המתוארת הסירה את כל החומר גרעיני מנתיve רקמת לב חזירית, יצירת לב ECM פיגום באתר ספציפי שיכול לשמש למגוון רחב של יישומים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי תאר מתודולוגיה לdecellularization עקבי והיעיל של לב חזירי. הפרוטוקול היה שינוי ל1 דו"ח שפורסם בעבר, וכלל חשיפה ארוכה יותר לזרימה ולחץ מוגבר, אשר ספקה תוצאות דיר יותר. רקמת decellularized התקבלה עמדה בכל הקריטריונים שפורסמו לdecellularization המוצלח של רקמה 2. שינו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות רוגן אורח, מישל וויבר, וקריסטן יפרט. מימון למחקר זה מסופק על ידי NIH גרנט R03EB009237, כמו גם מענקי NIH הדרכת T32EB001026-06 ממכון הלאומי לדימות וBioengineering ביו T32HL076124-05.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
