Genetisk modifiering och rekombination av saliv kulturer Gland Organ

Summary

En teknik för att genetiskt manipulera epitelceller i hela<em> Ex vivo</em> Odlade embryonala mus submandibulära körtlar (SMGS) med viral genöverföring beskrivs. Denna metod utnyttjar den inneboende förmågan hos SMG epitel och mesenkym att spontant rekombinera efter separation och infektion av epiteliala anlag med adenovirusvektorer.

Abstract

Förgrening morfogenes sker under utvecklingen av många organ, och den embryonala mus submandibular körtel (SMG) är en klassisk modell för att studera förgrening morfogenes. I utvecklingsländerna SMG innebär denna process iterativa steg epitelial knopp och kanal bildning, för att slutligen ge upphov till ett komplext förgrenad nätverk av acini och kanaler, som tjänar till att producera och modifiera / transportera saliv respektive in i munhålan ^{1 – 3.} Den epitel-associerad basalmembranet och aspekter av den mesenkymala facket, inklusive mesenkymceller, tillväxtfaktorer och extracellulära matrix, som produceras av dessa celler är avgörande för förgrening mekanismen, men hur de cellulära och molekylära händelser samordnas fortfarande dåligt känd ⁴ . Studien av de molekylära mekanismerna driver epiteliala morfogenes förskott vår förståelse av utvecklingsstörningar mekanismer och ger en inblick i eventuella Regenertiva medicin metoder. Sådana studier har hindrats på grund av brist på effektiva metoder för genetisk manipulation av saliv epitel. För närvarande representerar adenoviral transduktion den mest effektiva metoden för inriktning epitelceller hos vuxna körtlar in vivo ^5. Men i embryonala explantat, hindrar tät mesenkym och basalmembranet som omger epitelcellerna virala tillgång till de epiteliala cellerna. Om mesenkym avlägsnas, kan epitelet transfekteras med adenovirus, och epiteliala grunderna kan återuppta förgrening morfogenes i närvaro av Matrigel eller laminin-111 ^6,7. Mesenkym-fri epitelial rudiment tillväxt kräver också ytterligare tillskott med lösliga tillväxtfaktorer och inte helt rekapitulera förgrening morfogenes som förekommer i intakta körtlar ^8. Här beskriver vi en teknik som underlättar adenoviral transduktion av epitelceller och kultur transfekterade epithelium med tillhörande mesenkym. Efter mikrodissektion av de embryonala SMGs, avlägsnande av mesenkym, och viral infektion av epitelet med en GFP-innehållande adenovirus, visar vi att epitelet spontant rekombinerar med oinfekterade mesenkym, återupplever intakt SMG glandulär struktur och förgrening morfogenes. Den genetiskt modifierade epitelial cellpopulation kan lätt övervakas med användning av standardmetoder fluorescensmikroskopi metoder, om fluorescens-märkta adenovirala konstruktioner används. Vävnaden rekombination som beskrivs här är för närvarande den mest effektiva och tillgängliga metod för transfektion av epitelceller med en vildtyp eller mutant vektor inom en komplex 3D vävnad konstruktion som inte kräver generering av transgena djur.

Protocol

Protokollet innehåller fyra stora steg, som visas i figur 1. Alla steg beskrivs i detalj. Adenovirus konstruktion och viral rening bör utföras i förväg om organstölder för användning i den genetiska transduktion av de dissekerade epiteliala grunderna. Alla standard BSL-2 försiktighetsåtgärder bör följas vid arbete med adenovirus. 1. Mus embryonala submandibulär Gland (SMG) Skörd och mikrodissektion Avliva tidsinställda-gravida honmöss (utavlat sta…

Representative Results

Flödet av de stora experimentella steg skisseras i Figur 1. Ett exempel på en intakt SMG, en isolerad epitelial rudiment, och dess motsvarande mesenkym visas i figur 2. Brightfield bilder av rekombinerade SMGs, som fortsätter att genomgå förgrening morfogenes när odlade ex vivo under de angivna tiderna, visas i figur 3. Rekombinerade körtlar odlas för 48 timmar uttrycker epitelial GFP visas i figur 4. Konfokala bilder av rekombinerade S…

Discussion

Ex vivo epitel-mesenkymala rekombinationsteknik publicerades först på submandibulära spottkörtlar 1981 ^16. I detta protokoll utöka vi på den ursprungliga metoden, med hjälp av adenoviral infektion för att manipulera epitelial uttryck cell genen inom ramen för en rekombinerad körtel. Vi visar att en andel av de epiteliala cellerna infekteras med adenovirus, medan procentandelen av celler som är infekterade beror på egenskaperna hos den virala promotorn, viral titer, och viral renhet. Vi ha…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.