Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Summary

Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het gehele<em> Ex vivo</em> Gekweekte embryonale muis submandibulaire klieren (SMG) met behulp van virale gen-overdracht wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het aangeboren vermogen van SMG epitheel en mesenchym spontaan recombineren na scheiding en infectie van epitheliale rudiments met adenovirale vectoren.

Abstract

Vertakkende morfogenese optreedt tijdens de ontwikkeling van vele organen en de muis embryonale submandibulaire klier (SMG) is een klassieke model voor de studie van vertakking morfogenese. In ontwikkelingslanden SMG impliceert dit proces iteratieve stappen van epitheliale knop en kanaal vorming uiteindelijk leiden tot een complex netwerk van vertakte acini en leidingen, die dienen te produceren wijzigen en / transporteren speeksel, respectievelijk in de mondholte ^{1 – 3.} De epitheel-geassocieerde basaalmembraan en aspecten van de mesenchymale compartiment zoals de mesenchymcellen, groeifactoren en extracellulaire matrix, geproduceerd door deze cellen zijn essentieel voor de vertakking mechanisme, hoewel hoe de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen worden gecoördineerd echter niet goed begrepen ⁴ . De studie van de moleculaire mechanismen die epitheliale morfogenese ons begrip van ontwikkelingsmechanismen en geeft inzicht in mogelijke geregenereerdtieve geneeskunde benaderingen. Deze studies door het ontbreken van effectieve methoden voor genetische manipulatie van de speekselklieren epitheel belemmerd. Momenteel adenovirale transductie de meest effectieve methode voor het richten epitheelcellen in volwassen klieren in vivo ^5. Echter in embryonale explantaten, dichte mesenchym en de kelder membraan rond de epitheelcellen belemmert virale toegang tot de epitheelcellen. Als het mesenchym wordt verwijderd, kan het epitheel worden getransfecteerd met adenovirussen en epitheliale beginselen kunnen hervatten vertakking morfogenese in aanwezigheid van Matrigel of laminine-111 ^6,7. Mesenchym-vrij epitheliale rudiment groei vereist ook extra suppletie met oplosbare groeifactoren en niet volledig herhalen vertakking morfogenese als het zich voordoet in intacte klieren ^8. Hier beschrijven we een techniek die adenovirale transductie van epitheelcellen en cultuur van de getransfecteerde e vergemakkelijktpithelium met bijbehorende mesenchym. Na microdissectie van de embryonale SMG, verwijdering van het mesenchym en virale infectie van het epitheel met een GFP-bevattende adenovirus, aangetoond dat het epitheel spontaan recombineert met ongeïnfecteerde mesenchym met vermelding intact SMG glandulaire structuur en vertakking morfogenese. De genetisch gemodificeerde epitheliale celpopulatie kan eenvoudig worden gecontroleerd met standaard fluorescentiemicroscopiemethodes als fluorescent-gemerkte adenovirale constructen gebruikt. Het weefsel recombinatie hier beschreven methode is momenteel de meest efficiënte en toegankelijke methode voor transfectie van epitheelcellen met een wild-type of mutant vector in een complex 3D weefsel construct dat niet nodig genereren van transgene dieren.

Protocol

Het protocol bestaat uit vier stappen, zoals afgebeeld in figuur 1. Alle stappen worden beschreven in detail. Adenovirus constructie en virale zuivering te worden uitgevoerd vóór de orgaanroof voor gebruik in de genetische transductie van epitheliale rudiments ontleed. Alle standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het werken met adenovirussen. 1. Muis embryonale Submandibulaire Gland (SMG) Oogst en Microdissection Euthanaseren timed-zwang…

Representative Results

De stroom van de belangrijkste experimentele stappen wordt geschetst in figuur 1. Een voorbeeld van een intact SMG, een geïsoleerde epitheliale rudiment en de bijbehorende mesenchym zijn weergegeven in figuur 2. Helderveld beelden van gerecombineerde SMG, die nog steeds ondergaan vertakkende morfogenese indien gekweekt ex vivo gedurende de aangegeven tijden, worden getoond in Figuur 3. Gerecombineerde klieren gekweekt gedurende 48 uur tot expressie epitheliale…

Discussion

De ex vivo epitheliale-mesenchymale recombinatie techniek werd voor het eerst gepubliceerd voor submandibulaire speekselklieren in 1981 ^16. In dit protocol, we breiden de oorspronkelijke methode, met behulp van adenovirale infectie aan epitheliale cellen genexpressie te manipuleren in het kader van een gerecombineerde klier. Aangetoond dat het percentage van de epitheliale cellen geïnfecteerd met het adenovirus, dat het percentage cellen die zijn geïnfecteerd afhankelijk van de eigenschappen van de…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.