Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Summary

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta<em> Ex vivo</em> Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l'infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Abstract

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l'embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale ^{1 – 3.} Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa ⁴ . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell'epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo ^5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all'accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l'epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 ^6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti ^8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l'infezione virale dell'epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l'epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all'interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Protocol

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l'uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus. 1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection …

Representative Results

Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4.</…

Discussion

L'ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 ^16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l'infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l'adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.