唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合
Summary
遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術<em> ex vivoで</emウイルスの遺伝子導入を用いて>培養胚マウス顎下腺（サブマシンガン）が記述されている。この方法では、自発的にアデノウイルスベクターを用いた上皮初歩の分離及び感染後再結合する上皮と間充織をSMGの生得的な能力を活用しています。
Abstract
分枝形態形成することは、多くの臓器の開発中に発生し、マウス胎児の顎下腺（SMG）は、分枝形態形成の研究のための古典的なモデルである。 –最終的に口腔1に、それぞれ、唾液を生産し、変更/輸送するために役立つ腺やダクトの複雑な分岐鎖のネットワークを生じさせるために、上皮芽とダクト形成のステップを反復開発SMGでは、このプロセスが含まれます3。細胞および分子イベントがコーディネートされている方法が、これらの細胞によって産生される間葉細胞、成長因子や細胞外マトリックスを含む上皮関連基底膜と間葉コンパートメントの側面は、、、、分岐メカニズムに不可欠な貧弱4を理解して残っている。分子メカニズムの研究では、上皮の形態形成の進歩の発達メカニズムの理解を推進し、可能レーゲナーへの洞察を提供ative医学的アプローチ。このような研究は、唾液上皮の遺伝子操作のための効果的な方法が不足しているため妨げられてきた。現在、アデノウイルス形質導入は 、in vivo 5 で成人腺上皮細胞を標的とするための最も効果的な方法を表しています。しかし、胚外植片に、緻密間葉と上皮細胞を取り巻く基底膜は、上皮細胞へのウイルスのアクセスを妨げている。間充織が削除された場合は、上皮はアデノウイルスを用いてトランスフェクトすることができ、および上皮初歩はマトリゲルまたはラミニン-111 6,7の存在下で分岐形態形成を再開することができます。間葉フリー上皮原基の成長はまた、可溶性増殖因子と追加の補充を必要とし、それをそのまま腺8で発生したような完全に分岐形態形成を再現していません。ここでは、トランスフェクトされたeの上皮細胞と文化のアデノウイルス形質導入を容易にする技術を説明関連した間充織とpithelium。胚のサブマシンガン、間葉の除去、およびGFP含有アデノウイルスによる上皮のウイルス感染の顕微解剖に続いて、我々はそのままSMG腺構造をrecapitulatingと分枝形態形成、上皮が自発的に感染していない間充織と再結合することを示している。蛍光タグ付きアデノウイルスコンストラクトが使用されている場合、遺伝的に修飾された上皮細胞集団は簡単に、標準的な蛍光顕微鏡法を使用して監視できます。ここで説明された組織の組換え方法は、現在、トランスジェニック動物の生成を必要としない複雑な3次元組織構築物内に野生型または変異型ベクターを用いた上皮細胞のトランスフェクションのための最も効果的かつアクセス可能な方法である。
Protocol
プロトコルは、 図1に示した4つの主要な手順が含まれています。すべての手順が完全に詳細に記載されています。アデノウイルスの構築およびウイルス精製は解剖上皮初歩の遺伝形質で使用するための臓器摘出の前に実行する必要があります。アデノウイルスを扱うときは、すべての標準的なBSL-2の安全上の予防措置に従うべきである。 1。マウス胚性顎下腺?…
Representative Results
主要な実験手順のフローを図1に概説されています。無傷のSMGは、隔離された原基上皮、およびそれに対応する間充織の例を図2に示す。ときに指示された時間のために培養されたex vivoで分岐形態形成を継続して受ける組み換えられたサブマシンガンの明視野像を図3に示す。上皮GFPを発現している48時間成長させ再結合腺が図4</str…
Discussion
ex vivoでの上皮間葉組換え技術は、1981年に初めて16で顎下唾液腺のために公開されていました。このプロトコルでは、再結合された腺のコンテキスト内で上皮細胞の遺伝子発現を操作するためにアデノウイルス感染を用いて、元のメソッドを拡張。感染している細胞の割合は、ウイルスプロモーターの性質、ウイルス力価およびウイルス純度に依存するのに対し、我々は、上皮…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、有益なコメントや原稿の批判的な読みのための博士ディアドラネルソンに感謝したいと思います。この作品は、アルバニー大学、ニューヨーク州立大学にNIHの助成DE019244、DE019197、DE021841とMLに、F32DE02098001 SJSへ、そしてC06 RR015464によって賄われていた。
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. |
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Cite This Article
Sequeira, S. J., Gervais, E. M., Ray, S., Larsen, M. Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures. J. Vis. Exp. (71), e50060, doi:10.3791/50060 (2013).