Genmodifisering og Rekombinasjon av spyttkjertel Organ kulturer

Summary

En teknikk for å genetisk manipulere epitelceller i hele<em> Ex vivo</em> Kulturperler embryonale mus submandibular kjertler (maskingeværer) ved hjelp av viral genoverføring er beskrevet. Denne metoden tar fordel av medfødt evne SMG epitel og mesenchyme å spontant rekombinerer etter separasjon og infeksjon epiteliale barnelærdom med adenovirale vektorer.

Abstract

Forgrening morphogenesis oppstår under utviklingen av mange organer, og embryonale mus submandibular kjertel (SMG) er en klassisk modell for studiet av forgrening morphogenesis. I utviklingsland SMG, innebærer denne prosessen iterative trinn epitelisk knopp og kanalsystem formasjon, til slutt gir opphav til et komplekst forgrenet nettverk av acini og kanaler, som tjener til å produsere og modifisere / transportere spytt, henholdsvis inn i munnhulen ^{1 – 3.} Epiteliale-assosiert basalmembran og aspekter ved mesenchymale kupeen, inkludert mesenchyme cellene, vekstfaktorer og den ekstracellulære matrix, produsert av disse celler, er avgjørende for den forgrenede mekanismen, selv hvor de cellulære og molekylære hendelser koordineres forblir dårlig forstått ⁴ . Studiet av de molekylære mekanismene kjører epiteliale morphogenesis fremskritt vår forståelse av utviklingsmessige mekanismer og gir innsikt i mulige regenerativAtive medisin tilnærminger. Slike studier har blitt hemmet på grunn av mangel på effektive metoder for genetisk manipulasjon av salivary epitel. For tiden representerer adenoviral transduksjon den mest effektive metoden for målretting epitelceller i voksen kjertler in vivo ^5. Imidlertid i embryonale eksplanter, hemmer tett mesenchyme og basalmembran omgir epitelceller viral tilgang til epitelceller. Dersom mesenchyme er fjernet, kan epitelet bli transfektert med adenovirus, og epiteliale rudimenter kan gjenoppta branching morphogenesis i nærvær av Matrigel eller laminin-111 ^6,7. Mesenchyme-free epitelial rudiment vekst krever også ekstra tilskudd med oppløselige vekstfaktorer og ikke fullt rekapitulere forgrening morphogenesis som det skjer i intakte kjertler ^8. Her beskriver vi en teknikk som letter adenovirale transduksjon av epitelceller og kultur av transfekterte epithelium med tilhørende mesenchyme. Etter mikrodisseksjon av embryonale maskingeværer, fjerning av mesenchyme, og viral infeksjon i epitelet med en GFP-holdig adenovirus, viser vi at epitelet spontant recombines med infisert mesenchyme, rekapitulere intakt SMG glandular struktur og forgrening morphogenesis. Den genmodifiserte epitelcelleopprinnelse befolkningen kan lett overvåkes ved hjelp av standard fluorescens mikroskopi metoder, hvis fluorescently-merket adenovirale konstruerer brukes. Vevet rekombinasjon metoden beskrevet her er for tiden den mest effektive og tilgjengelige metode for transfeksjon av epitelceller med en vill-type eller mutert vektor i en kompleks 3D vev konstruere som ikke krever generering av transgene dyr.

Protocol

Protokollen inneholder fire hovedtrinn, som avbildet i figur 1.. Alle trinn er beskrevet i detalj. Adenovirus konstruksjon og viral rensing bør utføres i forkant av organrøveri for bruk i den genetiske transduksjon av dissekert epiteliale rudimenter. Alle standard BSL-2 sikkerhetsregler bør følges når man jobber med adenoviruses. 1. Mus Embryonic submandibular kjertel (SMG) Høsting og mikrodisseksjon Avlive tidsstyrt gravide hunnmus (outbred stamme CD-en el…

Representative Results

Flyten av de store eksperimentelle trinnene er skissert i Figur 1. Et eksempel på en intakt SMG, en isolert epitelial rudiment, og dens tilhørende mesenchyme er vist i figur 2. Lysfelt bilder av rekombinerte maskingeværer, som fortsetter å gjennomgå forgrening morphogenesis når kultivert ex vivo for de angitte tider, er vist i figur 3. Rekombinerte kjertler dyrket i 48 timer uttrykker epitelial GFP er vist i figur 4. Confocal bilder av re…

Discussion

Den tidligere vivo epitelial-mesenchymale rekombinasjon teknikken ble først publisert for submandibular spyttkjertler i 1981 ^16. I denne protokollen, utvider vi på den opprinnelige metoden med adenoviral infeksjon å manipulere epitelcelleopprinnelse genuttrykk innenfor rammen av en rekombinert kjertel. Vi viser at en prosentandel av epitelcellene er infisert med adenovirus, mens prosentandelen av celler som er infisert avhenger egenskapene til viral promotor, viral titer, og viral renhet. Vi har f…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.