Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda<em> Ex vivo</em> Cultivadas de embriones de ratón glándulas submandibulares (SMG) con transferencia génica viral se describe. Este método se aprovecha de la capacidad innata de SMG epitelio y el mesénquima para recombinarse espontáneamente después de la separación y la infección de rudimentos epiteliales con vectores adenovirales.
La morfogénesis de ramificación se produce durante el desarrollo de muchos órganos, y la glándula submandibular del ratón embrionario (SMG) es un modelo clásico para el estudio de la morfogénesis de ramificación. En la SMG desarrollo, este proceso implica pasos iterativos de brote epitelial y la formación del conducto, en última instancia, para dar lugar a una compleja red ramificada de acinos y conductos, que sirven para producir y modificar / transportar la saliva, respectivamente, en la cavidad oral de 1 – 3. La membrana basal epitelial asociada y los aspectos de la compartimiento mesenquimal, incluyendo las células del mesénquima, factores de crecimiento y la matriz extracelular, producidas por estas células, son críticos para el mecanismo de ramificación, aunque la forma de los acontecimientos celulares y moleculares están coordinados sigue siendo poco conocida 4 . El estudio de los mecanismos moleculares de conducción avances epiteliales morfogénesis nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo y da una idea de posible regeneraraproximaciones creativas medicina. Tales estudios se han visto obstaculizados por la falta de métodos eficaces para la manipulación genética del epitelio salival. Actualmente, la transducción adenoviral representa el método más eficaz para atacar a las células epiteliales de las glándulas adultos in vivo 5. Sin embargo, en los explantes de embriones, mesénquima y densa de la membrana basal que rodea las células epiteliales impide el acceso viral a las células epiteliales. Si el mesénquima se retira, el epitelio puede ser transfectadas utilizando adenovirus, y rudimentos epiteliales puede reanudar la morfogénesis de ramificación en presencia de Matrigel o laminina-111 6,7. Mesénquima crecimiento libre de rudimento epitelial también requiere suplementos adicionales con factores de crecimiento solubles y no completamente recapitular la morfogénesis de ramificación ya que se produce en las glándulas intactas 8. Aquí se describe una técnica que facilita la transducción adenoviral de las células epiteliales y la cultura de la e transfectadaspithelium con mesénquima asociado. Después de la microdisección de los subfusiles embrionarias, la eliminación de la mesénquima, y la infección viral del epitelio con un adenovirus que contiene GFP, se muestra que el epitelio espontáneamente recombina con mesénquima no infectada, recapitulando intacta la estructura glandular SMG y la morfogénesis de ramificación. La población de células epiteliales modificadas genéticamente pueden controlarse fácilmente utilizando métodos estándar de microscopía de fluorescencia, si fluorescentemente etiquetados construcciones adenovirales se utilizan. El método de recombinación de tejidos descrito aquí es actualmente el método más eficaz y accesible para la transfección de células epiteliales con un vector de tipo salvaje o mutante dentro de una construcción de tejido complejo 3D que no requiere la generación de animales transgénicos.
El ex vivo epitelial-mesenquimal técnica de recombinación fue publicado por primera vez por las glándulas salivales submandibulares en 1981 16. En este protocolo, se expanda en el método original, usando infección adenoviral para manipular la expresión génica de células epiteliales en el contexto de una glándula recombinado. Se demuestra que un porcentaje de las células epiteliales están infectadas con el adenovirus, mientras que el porcentaje de células que están infectadas depende de l…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a la Dra. Deirdre Nelson por sus valiosos comentarios y para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones DE019244, DE019197 y DE021841 a ML, F32DE02098001 a SJS, y RR015464 C06 a la Universidad de Albany, SUNY.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. |