Måling av levetid i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster er en kraftig modell organisme for å utforske den molekylære basis av lang levetid regulering. Denne protokollen vil diskutere trinnene involvert i å generere en reproduserbar, populasjonsbasert måling av lang levetid, så vel som potensielle fallgruver og hvordan unngå dem.
Abstract
Aldring er et fenomen som resulterer i jevn fysiologiske forverring i nesten alle organismer som har blitt undersøkt, fører til redusert fysisk yteevne og økt risiko for sykdom. Individuell aldring er manifest på befolkningsnivå som en økning i aldersavhengig dødelighet, som ofte måles i laboratoriet ved å observere levetid i store årskull av alder-matchet individer. Eksperimenter som forsøker å kvantifisere i hvilken grad genetisk eller miljømessige manipulasjoner innvirkning levetid i enkle modellorganismer har vært bemerkelsesverdig vellykket for å forstå aspekter ved aldring som er bevart på tvers taxa og inspirerende nye strategier for å utvide levetiden og hindre alder-assosiert sykdom hos pattedyr .
Eddik fly, Drosophila melanogaster, er en attraktiv modell for å studere mekanismene for aldring på grunn av sin relativt korte levetid, praktisk reindrift, og lettvinte genetikk.Imidlertid demografiske tiltak av aldring, inkludert alder-spesifikk overlevelse og dødelighet, er usedvanlig følsom for selv små variasjoner i eksperimentell design og miljø, og opprettholdelse av strenge laboratoriepraksis for varigheten av aldrende eksperimenter kreves. Disse hensynene, sammen med behovet for å øve nøye kontroll av genetisk bakgrunn, er avgjørende for å generere robuste målinger. Faktisk er det mange kjente kontroversene rundt slutning fra levetid eksperimenter i gjær, mark, flue og mus som har blitt sporet tilbake til miljømessige eller genetiske gjenstander 1-4. I denne protokollen beskriver vi et sett av prosedyrer som har blitt optimalisert over mange år for å måle levetid i Drosophila hjelp laboratoriet hetteglass. Vi beskriver også bruken av dLife programvare, som ble utviklet av vårt laboratorium og er tilgjengelig for nedlasting ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife akselererer gjennomstrømming og fremmer god praksis ved å innlemme optimal eksperimentell design, forenkle fly håndtering og datainnsamling, og standardisere data analyse. Vi vil også diskutere de mange potensielle fallgruver i design, innsamling og tolkning av levetid data, og vi gir skritt for å unngå disse farene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presenteres her beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av reproduserbare målinger av voksen levetid i Drosophila som er tilpasningsdyktige for vurdering av genetiske, farmakologiske, og miljømessige intervensjoner. Viktige aspekter av protokollen omfatter nøye kontrollere larve utviklingsmiljø, minimere voksen stress, og minimere skjevhet over eksperimentelle grupper og kontroller. Vi presenterer også bruk av dLife levetid eksperimentet management software. Ved ganske enkelt å feste en s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) og NIH R01AG030593 (SDP). Dette arbeidet utnyttet ressursene i Drosophila Aging Core (DAC) av Nathan Shock Center of Excellence i biologi av aldring finansiert av National Institute of Aging P30-AG-013 283 ( http://www.nih.gov/ ). Forfatterne ønsker å takke pletcher Laboratory for personer diskusjoner og spesielt Brian Chung for kritisk lesning av manuskriptet. Vi ønsker å erkjenne Nick Asher og Kathryn Borowicz for å få hjelp med innsamling av data.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an ‘aging gene’ in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?. PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
