Summary

Staphylococcus aureus एक आयरन स्रोत के रूप में मानव हीमोग्लोबिन का उपयोग ग्रोथ

Published: February 07, 2013
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Summary

हम यहाँ के लिए एक विकास परख का वर्णन<em> Staphylococcus aureus</em> उपलब्ध पोषक तत्व लोहे के एकमात्र स्रोत के रूप में हीमोग्लोबिन का उपयोग. इस परख बैक्टीरिया हीमोग्लोबिन व्युत्पन्न लोहे के अधिग्रहण में शामिल कारक की भूमिका को स्थापित करता है.

Abstract

एस aureus एक रोगजनक जीवाणु है कि महत्वपूर्ण चयापचय कार्यों और कारण रोग के लिए बाहर ले जाने के लिए लोहे की आवश्यकता है. मानव मेजबान के अंदर लोहे का सबसे प्रचुर मात्रा में जलाशय heme, जो हीमोग्लोबिन की cofactor है. हीमोग्लोबिन से लोहे का अधिग्रहण, एस. aureus एक विस्तृत लोहा विनियमित सतह (आईएसडी) निर्धारक 1 प्रणाली के रूप में जाना जाता प्रणाली का उपयोग किया जाता है. आईएसडी प्रणाली 1 बाँध मेजबान हीमोग्लोबिन के घटक, तो निकालने और हीम आयात, और अंत में हीम से बैक्टीरियल cytoplasm 2,3 में लोहे को आजाद कराने. इस मार्ग में इन विट्रो 4-9 अध्ययन में कई के माध्यम से किया गया dissected है. इसके अलावा, आईएसडी प्रणाली के संक्रमण के लिए योगदान को बार – बार किया गया है 8,10-14 माउस मॉडल में प्रदर्शन किया. हीमोग्लोबिन व्युत्पन्न अधिग्रहण लोहा आईएसडी प्रणाली के योगदान की स्थापना और विकास के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. विकास के लिए एक एकमात्र लोहे के स्रोत के रूप में हीमोग्लोबिन का उपयोग assays ख जटिल कर रहे हैंy व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीमोग्लोबिन की अस्थिरता, मध्यम विकास में नि: शुल्क लोहा contaminating और लोहे chelators के साथ जुड़े विषाक्तता. यहाँ हम एक तरीका है कि इन सीमाओं पर काबू उपस्थित थे. उच्च गुणवत्ता हीमोग्लोबिन ताजा रक्त से तैयार किया जाता है और तरल नाइट्रोजन में संग्रहित है. शुद्ध हीमोग्लोबिन में पूरक है मध्यम लोहे गरीब हड्डीवाला मेजबान के अंदर रोगजनकों द्वारा सामना वातावरण नकल उतार लौह खलाना. एस भूख से मुक्त लोहे की aureus और हीमोग्लोबिन की एक न्यूनतम चालाकी से फार्म के साथ हम एक तरह से है कि पूरी तरह से हीमोग्लोबिन बाँध, हीम निकालने के, बैक्टीरियल सेल लिफाफा के माध्यम से heme के पास और cytoplasm में हीम नीचा करने की क्षमता पर निर्भर है में वृद्धि प्रेरित सप्लीमेंट. इस परख शोधकर्ताओं एस में hemoglobin-/heme-derived लोहे के अधिग्रहण के तंत्र को स्पष्ट करने की मांग के लिए उपयोगी हो जाएगा aureus और संभवतः अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों.

Protocol

1. हीमोग्लोबिन की ताजा रक्त से शोधन ताजा मानव एक anticoagulant के साथ पूरक रक्त मोल. शुद्धि भर में बर्फ पर या 4 में रक्त डिग्री सेल्सियस रखें. 1500 x छ पर 20 मिनट के लिए रक्त अपकेंद्रित्र. लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) की ट…

Representative Results

हम hemolysate से मानव हीमोग्लोबिन शुद्ध HPLC (प्रोटोकॉल 1.7 कदम) के साथ चित्रा 1 से पता चलता है कि 280 और 410 एनएम तरंगदैर्य पर प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक की absorbance दर्ज. 5 अंश एकत्र किया गया था और अन्य frac…

Discussion

लोहे की एक आवश्यक 15 जीवन के सभी राज्यों से जीवों के लिए आवश्यक पोषक तत्व है. रीढ़ में, लोहे के इस तत्व के कारण विषाक्तता से बचने के तनहा है. इस ज़ब्ती भी एक पोषण 16 उन्मुक्ति के रूप में जाना जाता है क?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस शोध अमेरिका के एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा AI69233 और AI073843 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. ईपीएस के संक्रामक रोगों के रोगजनन में एक Burroughs Wellcome बंदे है. किमी सेलुलर और आण्विक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रशिक्षण अनुदान 5 कार्यक्रम T32 A107611-10 के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin’s reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. 생화학. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
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Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

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