Isolering og kultur myofibre er guldstandarden<em> In vitro</em> System til at studere overgangen af satellit celler gennem ro, aktivering og differentiering. Vigtigere er det, den enkelte myofiber kultur-system bevarer myofiber / stamcelle forening, som er en væsentlig bestanddel af muskel stamceller niche.
Muskelregenerationen i den voksne udføres af hjemmehørende stamceller kaldet satellit celler. Satellitceller er defineret ved deres position mellem den basale lamina og sarcolemma af hver myofiber. Aktuelle viden om deres adfærd er stærkt afhængig af brugen af den fælles myofiber isolation protokol. I 1985 beskrev Bischoff en protokol til at isolere enkelte levende fibre fra flexor digitorum brevis (FDB) af voksne rotter med det formål at skabe et in vitro system, hvori den fysiske forbindelse mellem myofiber og dens stamceller bevares 1. I 1995 Rosenblattmodified den Bischoff-protokollen således at myofibre er enkeltvis plukkes og håndteres adskilt efter collagenasefordøjelse stedet for at blive isoleret ved gravitationssedimentation 2, 3. Den Rosenblatt eller Bischoff protokol er siden blevet tilpasset forskellige muskler, alder eller betingelser 3-6. Den enkelte myofiber isolation teknik er et uundværligtværktøj på grund af dens unikke fordele. Dels i det indre myofiber protokollen, er satellit-celler opretholdt under basale lamina. Dette er en unik funktion i protokollen som andre teknikker, såsom fluorescensaktiveret cellesortering kræver kemisk og mekanisk væv dissociation 7. Selvom myofiber kultur-systemet ikke kan erstatte in vivo-undersøgelser, betyder det tilbyde en fremragende platform til at løse relevante biologiske egenskaber af muskel stamceller. Single myofibre kan dyrkes i standard plating forhold eller i flydende betingelser. Satellitceller på flydende myofibre udsættes for praktisk talt ingen yderligere indflydelse end myofiber miljø. Substrat stivhed og overtræk har vist sig at påvirke satellit cellers evne til at regenerere muskler 8, 9, således at kunne styre hver af disse faktorer uafhængigt tillader diskriminering mellem niche-afhængige og-uafhængige reaktioner. Forskellige koncentrationer af serum harogså vist sig at have en virkning på overgangen fra hviletilstand til aktivering. For at bevare quiescence tilstand af de tilknyttede satellitceller, bør fibrene opbevares i lavt serum-medium 1-3. Dette er særligt nyttigt, når studere gener involveret i hvile tilstand. I serum rigt medium, satellit celler hurtigt aktivere, formere sig, migrere og differentiere, hvilket efterligner in vivo regenerative proces 1-3. Systemet kan anvendes til at udføre en række assays, såsom undersøgelse af kemiske inhibitorer, ektopisk ekspression af gener af virus levering, oligonucleotid baseret Knock-down eller direkte billedvisning. Videoen artikel beskriver protokollen for tiden anvendes i vores laboratorium at isolere enkelte myofibre fra extensor digitorum Longus (EDL) muskel i voksne mus (6-8 uger gamle).
The isolering og dyrkning af enkelte myofibre fra intakte muskler giver en fremragende in vitro-model til at undersøge fremgangsmåden ifølge muskelregenerationen. En unik egenskab ved dette system er bevarelsen af satellitceller i deres fysiologiske miljø under basale lamina. Vigtigst kan teknikken benyttes til at undersøge muskel stamceller adfærd i både hviletilstand og aktiverede tilstande. Gennem de sidste 20 år har myofiber dyrkningssystemet billede meningsfulde indsigt i biologi satellitcelle population med hensyn til både indre og ydre faktorer. Ved dyrkning af individuelle myofibre, er satellitcelle heterogenitet med hensyn til myofiber, muskel type eller regenerationsevne blevet behandlet 15. Udarbejde studier med levende billeder af enkelte dyrkede fibre tilladt for den modtagende information om satellit cellemigration mønster 16. Købet af kvantitative data er etLSO muligt. Selvom tidskrævende, giver det væsentlige oplysninger om fordelingen og indtræden af bestemte hændelser (stamceller asymmetrisk division, proliferation og differentiering forhold osv.). Sammen med tidligere beskrevne anvendelser, protein eller RNA-ekstraktion fra enkelte fibre er også muligt, selv om isolering af ren population af satellit-celler ved FACS eller andre midler kan tilvejebringe et bedre grundlag til at undersøge protein-eller genekspression ændringer på molekylært niveau. Det er vores erfaring, er det mest kritiske skridt for en vellykket fiber isolering af "sene til senen" isolation (trin fra 2,5 til 2,9 i protokollen tekst). Dette garanterer, at efter muskel fordøjelse, er fibre frigøres fra EDL med minimal eller ingen skade og dermed øge deres præstationer i de følgende trin.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Sarah Dick for at yde kritisk læsning og kommentarer. MAR holder Canada Research Chair i Molekylær Genetik og er en International Research Scholar af Howard Hughes Medical Institute. Dette arbejde blev støttet af tilskud til MAR fra National Institutes of Health, Howard Hughes Medical Institute, den canadiske Institutes of Health Research, den Muskelsvindfonden Association og Canada Research Chair Program.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |