Isolering og Kultur Mouse Cortikale Astrocytes

Summary

Astrocytter er blevet anerkendt for at være alsidige celler, der deltager i fundamentale biologiske processer, der er afgørende for normal hjernens udvikling og funktion, og det centrale nervesystem reparation. Her præsenterer vi en hurtig procedure for at opnå rene mus astrocyt kulturer at studere biologi af denne store klasse af centralnervesystemet celler.

Abstract

Astrocytter er en rigelig celletype i den mammale hjerne, men er stadig meget at lære om deres molekylære og funktionelle egenskaber. In vitro astrocyt cellekultursystemer kan anvendes til at studere de biologiske funktioner af disse gliaceller i detaljer. Denne video protokol viser, hvordan til opnåelse af rene astrocytter efter isolering og dyrkning af blandede corticale celler af muse-unger. Fremgangsmåden er baseret på fravær af levedygtige neuroner og adskillelse af astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia, de tre vigtigste glial cellepopulationer i centralnervesystemet, i kultur. Repræsentative billeder i de første dages dyrkning viser tilstedeværelse af en blandet cellepopulation og angiver tidspunkterne, når astrocytter bliver sammenflydende og skal adskilles fra mikroglia og oligodendrocytter. Desuden viser vi renhed og astrocytisk morfologi af dyrkede astrocytter anvender immuncytokemiske farvninger for veletableret ognyligt beskrevne astrocyt-markører. Dette dyrkningssystem kan let anvendes til opnåelse af rene murine astrocytter og astrocyt-konditioneret medium til undersøgelse af forskellige aspekter af astrocyt biologi.

Introduction

Astrocytter er en meget rigelige celletype i centralnervesystemet (CNS). Forholdet mellem astrocytter til neuroner er 1:3 i cortex hos mus og rotter, mens der er 1,4 astrocytter pr neuron i den humane cortex ^1. Interessen for astrocyt funktion er steget dramatisk i de seneste år. En vigtig funktion af astrocytter er deres rolle i at yde strukturel og metaboliske støtte til neuroner ^2,3. Nyopdagede roller for astrocytter dækker et bredt spektrum af funktioner. Disse omfatter styre migrationen af udviklingslandene axoner og visse neuroblaster under udvikling ^4-6, funktioner i synaptisk transmission, synapse styrke og informationsbehandling ved neurale kredsløb ^7-9, roller i blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​formation ¹⁰ og integritet ^11-13 og regulering af cerebrovaskulær tone ^14. Et andet væsentligt træk ved astrocytter er deres respons på skade. Under patologiske betingelser astrocytes bliver reaktiv og yderligere opregulere ekspressionen af det intermediære filament glialt fibrillært surt protein (GFAP) og inhibitoriske ekstracellulær matrix (ECM) proteiner ^15,16. Reaktive astrocytter afgrænse skaden site fra sundt væv ved at danne en glial ar, der hovedsagelig består af astrocyt secernerede ECM proteiner af chondroitinsulfat proteoglycan (CSPG) familie, de vigtigste faktorer, der hæmmer axonal regenerering efter skade på centralnervesystemet ^15-17.

Astrocytter stammer fra radiale gliaceller (RG) celler under sen embryogenese og tidlig postnatal liv. Efter astrocyt specifikation har fundet sted, astrocyt-prækursorer migrerer til deres endelige positioner, hvor de begynder processen med terminal differentiering. In vivo, astrocytter synes at være modne tre til fire uger efter fødslen som angivet ved deres typiske morfologi ^18,19. En subpopulation af RG celler konverterer til subventricular zone astrocytter (type B-celler). Both, RG-og type B-celler fungere som astrocyt-lignende neurale stamceller (NSC) under udvikling og i den voksne hhv. Ligesom astrocytter, RG-og type B-celler endvidere udtrykker astrocyt-specifikke glutamat transportør (GLAST), hjerne-lipid-bindende protein (BLBP), og GFAP, hvilket indikerer, at disse markører ikke kan udelukkende anvendes til specifikt mærke voksne astrocytter. I modsætning til voksne parenchymale astrocytter, som ikke deler i den sunde hjerne, RG og type B-celler udviser stamceller potentiale såsom evnen til selv at forny. Dysregulering af astrocytter er blevet impliceret i adskillige patologier, herunder Alzheimers sygdom ^20,21, Huntingtons sygdom ^22, Parkinsons sygdom ^23, Rett syndrome ²⁴ og Alexander sygdom ^25. Endvidere astrocytter reagere på alle fornærmelser i CNS, hvilket fører til astrocyt aktivering og astrocytisk glial ardannelse ^16,26. Den astrocytisk glial ar, der danner således hjerne trAUMA eller rygmarvsskade menes at være den primære barriere for neuronal regenerering ^15.

Udviklingen af ​​pålidelige metoder til at isolere og vedligeholde oprensede populationer af celler har været afgørende for vores forståelse af nervesystemet. Banebrydende forskning fra McCarthy og de ​​Vellis giver efterforskerne til dato for at forberede næsten rene kulturer af astrocytter fra neonatal rotte væv ^27. Meget er blevet lært om astrocyt biologi ved hjælp af denne metode, som præsenteres her i en let ændret form til isolering af muse corticale astrocytter. Som supplement in vivo-undersøgelser, astrocytter og konditioneret medium opnås ved hjælp af den beskrevne in vitro-dyrkning, er værdifulde værktøjer til yderligere at få indsigt i astrocyt-funktioner.

Protocol

1. Isolering og udpladning af blandede kortikale celler Blandede corticale celle-isolation for astrocyt-kulturer kan udføres med P1 til P4 mus unger. For at opnå korrekt astrocyt densitet er det nødvendigt at anvende 4 mus pup cortices per T75 vævskulturkolbe. Derfor er mængderne i følgende protokol beregnet for en celle præparat med 4 mus hvalpe. Før start af dissektion procedure, forvarm 30 ml astrocyt-kulturmedier (DMEM, high glucose + 10% varmeinaktiveret kalvefosterse…

Representative Results

Efter isolering af det komplette musehjernen (fig. 1A), cerebellum og de ​​olfaktoriske pærer skal fjernes (figur 1B). De cortexer skrællet af muse hjernestammen (figur 1C) og meninges den enkelte cortex (figur 1D) omhyggeligt fjernes (fig. 1E). Meninges er indlysende af meningeal arterie, og ufuldstændig fjernelse resulterer i kontaminering af det færdige astrocyt kultur ved meningeal celler og fibroblaster. <p class="jove_…

Discussion

Fremgangsmåden beskrevet her er baseret på astrocyt kulturpræparat fra gnaver neonatale hjerner, som oprindeligt beskrevet af McCarthy og de ​​Vellis i 1980 ^27. Den modificerede fremgangsmåde til isolering og dyrkning af corticale astrocytter fra postnatal P1 til P4 musehjerne præsenteret her er hurtig, udbytter rene primære astrocytter og er yderst reproducerbar. Denne teknik kan let overføres til isolering astrocytter fra andre arter, såsom fra rotte eller gris og fra andre hjerneregioner, såso…

Materials

Name of working solution	Company	Catalogue number	Final concentration
			Astrocyte culture media
DMEM, high glucose	Life Technologies	31966-021
FBS, heat-inactivated	Life Technologies	10082-147	Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122	Final Concentration: 1%
			Solution for brain tissue digestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
2.5% Trypsin	Life Technologies	15090-046	Final Concentration: 0.25%
			기타
70% (vol/vol) ethanol	Roth	9065.2
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E	50 μg/ml
Water	PAA	S15-012	cell culture grade
PBS	PAA	H15-002	cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-062
0.45 μm Sterile filter	Sartorius	16555
3.5 cm petri dish	BD Falcon	353001
15 ml Falcon tube	BD Falcon	352096
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070
75 cm2 Tissue culture flask	BD Falcon	353136
Forceps, fine	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
Forceps, flat tip	KLS Martin	12-120-11
13 cm surgical scissors	Aesculap	BC-140-R
Stereomicroscope	Leica		MZ7.5
Stereomicroscope + Camera	Leica		MZ16F; DFC320
Microscope + Camera	Zeiss; Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuge	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Water bath	Julabo		SW20; 37 °C