דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד
Summary
הפרוטוקול הבא מספק טכניקות לencapsulating לבלב β-תאים בידרוג PEG-פפטיד שלב צמיחה שהוקם על ידי thiol-ene תגובות תמונה בלחיצה. פלטפורמת חומר זה לא רק מציעה microenvironment cytocompatible אנקפסולציה תא, אלא גם מאפשרת התאוששות מהירה למשתמש שליטה מלאה של מבני תא נוצרה בתוך הידרוג.
Abstract
הידרוג הם פולימרי crosslinked הידרופילי המספקים microenvironment תלת ממדים עם רקמות כמו גמישות וחדירות גבוהות לתאים או רקמות טיפוליות רלוונטיים culturing. הידרוג הוכן מפולי (אתילן גליקול) (PEG) נגזרים משמשים יותר ויותר למגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות, בחלקו בשל המאפיינים מתכוננים וcytocompatible. בפרוטוקול זה, אנו מנוצלים thiol-ene photopolymerizations שלב צמיחה לפברק הידרוג PEG-פפטיד לencapsulating לבלב MIN6 תאי B. הג'לים נוצרו על ידי 4-זרוע PEG-norbornene macromer (PEG4NB) וcrosslinker פפטיד chymotrypsin רגיש (CGGYC). הטבע הידרופילי ולא עכירות של PEG מציע microenvironment cytocompatible להישרדות תא והתפשטותו ב3D, תוך השימוש ברצף פפטיד chymotrypsin הרגיש (C GGY ↓ C, חץ מציין אתר מחשוף אנזים, בעוד ציסטה מסוףשאריות eine נוספו לcrosslinking thiol-ene) מאפשר התאוששות מהירה של מבנים בתוך תא יוצרים הידרוג'ל. הפרוטוקול הבא מפרט טכניקות ל: (1) Encapsulation של MIN6 β-תאים בthiol-ene הידרוג; (2) מבחני כדאיות סלולרית איכותיים וכמותיים לקביעת הישרדות תא ושגשוג; (3) שחזור של שספרואידים סלולריים באמצעות ג'ל chymotrypsin בתיווך שחיקה; ו (4) ניתוח מבני ותפקודי של הספרואידים התאוששו.
Introduction
הידרוג הם פולימרי crosslinked הידרופילי עם פוטנציאל יוצא דופן כחומרי פיגומים לרקמות תיקון והתחדשות. 1-3 תכולת המים הגבוהה של הידרוג מאפשרת דיפוזיה קלה של חמצן וחומרים מזינים חילופים ומוצרים מטבוליות סלולריים, שכולם חיוניים לשמירה על כדאיויות תא. בנוסף, הידרוג הם נישא מצוין לשחרור מבוקר ומשלוח תא בשל tunability הגבוה שלהם. 2 הידרוג סינטתית כגון אלה שהוכנו מפולי (אתילן גליקול) (PEG) משמשים יותר ויותר ביישומי הנדסת רקמות, בעיקר בשל cytocompatibility, רקמות כמו אלסטיות, וtunability גבוה בחומר תכונות פיסיקליות ומכאניות. 4-6
למרות פלטפורמת הידרוג נפוץ, מחקרים הראו כי PEG diacrylate (PEGDA) הידרוג נוצרה על ידי photopolymerizations שרשרת צמיחה יש נטייה לפגוע בתאים במארז duricrosslinking ng הרשת ובאתרו אנקפסולציה תא. 7 ניזק לתאים יוחס בעיקר למינים רדיקליים שנוצרו על ידי מולקולות photoinitiator, אשר מתפשטות דרך הקבוצות ויניל על PEGDA לשרשרות פולימר לתוך Crosslink הידרוג. למרבה הצער, מינים רדיקליים אלה גם לגרום ללחצים וניזקים סלולריים בעת אנקפסולציה תאים, במיוחד לתאים קיצוניים רגישים כגון לבלב β-תאים. 8-10 על מנת לקבל את גודל רשת גבוהה יותר עבור דיפוזיה טובה יותר והישרדות תא, משקולות מולקולריות גבוהות יותר PEGDA משמש לעתים קרובות לאנקפסולציה תא. זה, לעומת זאת, פוגע בקינטיקה פולימריזציה וגורם למאפייני biophysical ג'ל תת אופטימליים. 7,11,12 בנוסף לחסרונות שהוזכרו לעיל, זה מאוד קשה להתאושש ממבני תאי הידרוג PEGDA בשל ההטרוגניות ושאינן מתכלה, אופי רשתות crosslinked. בעוד פפטידים פרוטאז רגישים יכולים להיות משולביםלשדרת PEG macromer כדי להבהיר את הידרוג PEGDA אחרת אינרטיים הרגישה למחשוף האנזימטית, הנטייה לעתים קרובות משתמשת בריאגנטים יקרים ורשתות כתוצאה עדיין מכילות רמה גבוהה של הטרוגניות בשל האופי של פילמור בשרשרת צמיחה. 13-15
לאחרונה, הידרוג PEG-פפטיד שנוצרה באמצעות צעד צמיחת photopolymerization thiol-ene הוכחה להציג תכונות מועדפות לאנקפסולציה תא מעל הידרוג נוצרה על ידי photopolymerization שרשרת צמיחה. 7 קינטיקה gelation המעולה של thiol-ene הידרוג מיוחסת ל'קליק "טבעה של תגובה בין פונקציות Ene thiol ו. בהשוואה לפילמור בשרשרת צמיחה של PEGDA, תגובת thiol-ene פחות חמצן שתוצאתו שיעור gelation מהר יותר. עכבות 16,17 הידרוג Thiol-ene גם יעילות גבוהה יותר ופילמור מאפייני biophysical ג'ל טובים יותר בהשוואה לשרשרת צמיחת PEGDA הידרוג, 7 , 18 </ Sup> שתוצאתו ניזק לתאים הנגרם על ידי זנים מוגבלים קיצוניים במהלך photopolymerization.
בעבר, הידרוג thiol-ENE הוקמה על ידי 4-זרוע PEG-norbornene (PEG4NB) macromer וcrosslinkers bis-ציסטאין המכיל פפטיד, כגון פרוטאז רגישים פפטידים כבר נוצל לאנקפסולציה תא. Tunability גבוה 7,18 של רשתות הידרוג PEG מציע microenvironment גמיש והשליטה 3D לחקירת הישרדות תא ופעילות, תוך השימוש ברצף פפטיד פרוטאז הרגיש מספק דרך קלה להתאוששות של מבני תא שנוצרו באופן טבעי בתוך הידרוג. בפרוטוקול זה אנו מנצלים צעד צמיחת photopolymerized thiol-ene הידרוג המפוברקת באמצעות 4-זרוע PEG-norbornene (PEG4NB) וcrosslinker פפטיד chymotrypsin רגיש (CGGY ↓ C) לאנקפסולציה של MIN6 תאי β. פרוטוקול זה מרחיב באופן שיטתי ללימוד טכניקות הישרדות, השגשוג ואליפטית היווצרות MIN6β-תאים בידרוג thiol-מז. בנוסף, אנו מספקים שיטה להתאוששות אליפטית β-תאים ואפיון ביולוגי של שספרואידים התאוששו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר מציג פרטים על אנקפסולציה הקלה של תאים בידרוג thiol-ene נוצר על ידי photopolymerization שלב צמיחה. בעוד שיחס של 1:1 של stoichiometric norbornene לקבוצות פונקציונליות thiol היה בשימוש בפרוטוקול זה, היחס יכול להיות מותאם בהתאם לניסויים. בנוסף לניסוח נכון, חשוב לשמור על אחידות בפתרו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי NIH (R21EB013717) וIUPUI OVCR (RSFG). המחבר מודה גב 'האן שי לקבלת הסיוע הטכני שלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
