Framställning av tumörantigen-laddade mogna dendritceller för Immunotherapy
Summary
Den vanligaste metoden för att generera ett stort antal autologa dendritiska celler (DC) för användning i tumörimmunterapi beskrives. Metoden använder IL-4 och GM-CSF att skilja DCs från monocyter. De omogna DC stimuleras att mogna och sedan lastas med antigener innan de injiceras tillbaka in i patienten.
Abstract
Medan kliniska studier har visat att antigen-laddade DC vacciner är säkra och lovande terapi för tumörer 1, förblir deras kliniska effekt som skall fastställas. Metoden som beskrivs nedan, upprättats i enlighet med Good Manufacturing Process (GMP) riktlinjer, är en optimering av de vanligaste ex vivo förberedelse metod för att generera ett stort antal DCs för kliniska studier 2.
Vår metod utnyttjar den syntetiska TLR 3 agonist Polyinosinic-polycytidylsyra Acid-poly-L-lysin Karboxymetylcellulosa (Poly-ICLC) för att stimulera utvecklingsländerna. Vår tidigare studie visat att Poly-ICLC är den mest potenta individuell mognad stimulans för mänskliga DCs som bedömt av en uppreglering av CD83 och CD86, induktion av interleukin-12 (IL-12), tumörnekrosfaktor (TNF), interferon-gamma-inducerad protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) och typ I interferoner (IFN), och minimal interleukin 10 (IL-10) produktion. </p>
Utvecklingsländerna är differentierade från frusna perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhålls genom leukaferes. PBMC isoleras genom Ficoll gradientcentrifugering och frystes i alikvoter. Vid dygn 1, är PBMC tinades och plattades på vävnadsodlingskolvar för att selektera för monocyter som vidhäftar till plastytan efter 1-2 timmars inkubering vid 37 ° C i vävnadsodlingsinkubator. Efter inkubation lymfocyterna tvättas bort och de vidhäftande monocyterna odlas under 5 dagar i närvaro av interleukin-4 (IL-4) och granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) att differentiera till omogna DC. På dag 6, är omogna DC pulsade med keyhole limpet hemocyanin (KLH)-protein som fungerar som en kontroll för kvaliteten av vaccinet och kan öka immunogeniciteten hos vaccinet 3. DCS stimuleras att mogna, laddad med peptidantigener, och inkuberades över natten. På dag 7, tvättas cellerna, och frystes i alikvoter om 1 ml innehållande4-20 x 10 6 celler med användning av en kontrollerad-rate frys. Lot frisläppande för partier av DCs utförs och måste uppfylla minimikraven innan de injiceras i patienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fas I och II kliniska prövningar av monocythärledda DCs har visat att de inducerar immunsvar hos patienter men klinisk framgång har begränsats 1. Detta kan delvis bero på att det saknas enighet om hur man skapar de optimala DCs för tumör immunotherapeutic bruk. Även om det finns många sätt att generera klinisk-grade DCs, dessa metoder varierar i termer av användningen av cytokiner som används för att differentiera monocyter, stimuli som används för att inducera mognad, och metoder för antigen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Andres Salazar (Oncovir, Inc.) för gåvan av Poly-ICLC.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. 암 연구학. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
