Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie
Summary
Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.
Abstract
Obwohl klinische Studien festgestellt haben, dass Antigen-beladenen DC Impfstoffe sicher und viel versprechende Therapie für Tumore 1 sind, bleibt ihre klinische Wirksamkeit festgelegt werden. Das nachfolgend beschriebene Verfahren, hergestellt gemäß Good Manufacturing-Verfahren (GMP)-Richtlinien, ist eine Optimierung der häufigste ex vivo Herstellungsverfahren zur Erzeugung einer großen Anzahl von DCs für klinische Studien 2.
Unsere Methode nutzt die synthetischen TLR-Agonisten Polyinosin 3-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC), um die DCs zu stimulieren. Unsere früheren Studie festgestellt, dass Poly-ICLC die stärkste einzelne Reifung Stimulus für den menschlichen DCs ist, wie durch eine Hochregulation von CD83 und CD86, Induktion von Interleukin-12 (IL-12), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferon-gamma-induzierten beurteilt Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) und Typ-I-Interferonen (IFN) und minimal Interleukin 10 (IL-10) Produktion. </p>
DCs sind aus gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von Leukapherese erhalten differenziert. PBMCs durch Ficollgradientenzentrifugation isoliert und in Aliquots eingefroren. Am Tag 1 werden PBMCs aufgetaut und überzogen auf Gewebekulturflaschen für Monozyten, die auf der Kunststoffoberfläche nach 1-2 h Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekulturinkubator haften wählen. Nach der Inkubation werden die Lymphozyten durch Waschen entfernt und die anhaftenden Monozyten werden für 5 Tage in Gegenwart von Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zu unreifen DC differenzieren kultiviert. Am Tag 6 werden unreife DCs mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)-Protein, das als eine Kontrolle für die Qualität der Impfstoff dient und die Immunogenität der Impfstoff 3 steigern gepulst. Die DCs stimuliert werden, um zu reifen, beladen mit Peptid-Antigene, und über Nacht inkubiert. Am 7. Tag wurden die Zellen gewaschen und in 1 ml eingefroren Aliquots, welche4 – 20 x 10 6 Zellen mit einer kontrollierten Rate Gefrierschrank. Lot Release-Tests für die Chargen von DCs durchgeführt und müssen Mindestanforderungen erfüllen, bevor sie in die Patienten injiziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Phase-I-und-II-Studien von Monozyten-abgeleiteten DCs haben gezeigt, dass sie Immunreaktionen induzieren in Patienten jedoch klinische Erfolg wurde 1 beschränkt. Dies kann zum Teil auf den Mangel an Konsens darüber, wie die optimalen DCs für die Tumor-Immuntherapie Verwendung erzeugen. Obwohl es zahlreiche Möglichkeiten, um klinische Studien zu DCs zu erzeugen, unterscheiden sich diese Verfahren im Hinblick auf die Verwendung von Zytokinen, die Monozyten, Stimuli, um die Reifung zu induzieren, und die Met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Andres Salazar (Oncovir, Inc.) für das Geschenk des Poly-ICLC danken.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
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