免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製
Summary
腫瘍免疫療法に使用するための自己樹状細胞（DC）を大量に生成するための最も一般的に使用される方法が記載されている。この方法は、単球から樹状細胞を区別するためにIL-4およびGM-CSFを使用する。彼らは患者に再び注入される前に、未成熟DCは、成熟した後、抗原でロードに刺激される。
Abstract
臨床研究は、抗原·ロードDCワクチンは腫瘍1のための安全かつ有望な治療法であり、それらの臨床的有効性が確立されて残っていることが確立しているが。方法は、良好な製造技術（GMP）のガイドラインに準拠して作成、後述するように、臨床研究のためのDC 2を大量に生成するための最も一般的なex vivoでの調製方法の最適化である。
提案手法では、樹状細胞を刺激するための合成TLR 3アゴニストポリイノシン – ポリシチジル酸 – ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を利用する。 CD83およびCD86のアップレギュレーションにより評価されるポリICLCはヒトDCのための最も強力な個々の成熟刺激であることが確立我々の以前の研究では、インターロイキン12の誘導（IL-12）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロンγ誘起タンパク質10（IP-10）、interleukmin 1（IL-1）、I型インターフェロン（IFN）、および最小のインターロイキン10（IL-10）産生。 </p>
樹状細胞は、白血球搬出により得られた凍結末梢血単核細胞（PBMC）から区別される。 PBMCを、フィコール勾配遠心分離によって単離し、アリコートで凍結する。 1日目では、PBMCを解凍され、℃の中の組織培養インキュベーターで、37〜2時間インキュベートした後、プラスチック表面に付着した単球を選択するために組織培養フラスコに播種。インキュベーション後、リンパ球が洗い落とされ、接着単球を未成熟DCに分化するインターロイキン-4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の存在下で5日間培養する。 6日目に、未成熟DCは、ワクチンの品質の制御として機能し、ワクチン3の免疫原性を高めることがキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）タンパク質でパルスされています。 DCは、成熟に刺激ペプチド抗原を搭載し、一晩インキュベートする。 7日目に、細胞を洗浄し、含有する、1mlのアリコートで凍結4 -制御された速度冷凍庫を使って20×10 6細胞。 DCのバッチのロットリリーステストが行われ、それらが患者に注入される前に、最低限の仕様を満たしている必要があります。
Protocol
1。 PBMCを4の単離と凍結保存無菌スパイクプラズマ転送セットを使用して、白血球搬出袋のアクセスポートのいずれ。 60ミリリットル注射器を用いて、無菌の500mlボトルに患者から得られた白血球搬出を転送する。 室温RPMIを用いて元のボリュームを2倍に白血球搬出の音量を調整します。徹底的に混ぜる。 優しくフィコール – Paque PLUSのボトルを混ぜて。滅菌50ミ?…
Representative Results
10との間 – 出発したPBMCの20％は培養期間の終了時にDCへと分化する。成熟DCはあるのCD11c +、CD14-、CD83 +、CD40 +、およびCCR7 +（ 図1）。それらは、MHCクラスIおよびII分子および共刺激分子CD80およびCD86の高いレベルを発現する。他のTLRアゴニスト14と比較して、ポリICLCまた、PDL-1の低レベルを誘導した。さらに、これらのポリIC-成熟DCを分泌する大IL-12の量（ 図2及…
Discussion
フェーズIおよびIIは、単球由来樹状細胞の臨床試験は、患者しかしながら、臨床的成功は1に限定されているにおける免疫応答を誘導することが示されている。これは、腫瘍免疫療法用に最適DCを生成する方法に関するコンセンサスが不足している一因であってもよい。臨床グレードのDCを生成する多数の方法があるが、これらの方法は、単球、成熟を誘導するために使用される刺激、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ポリICLCの贈り物のためにアンドレスサラザール（Oncovir株）に感謝したいと思います。
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
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Cite This Article
Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).