Utarbeidelse av Tumor Antigen-lastet Moden dendrittiske celler for Immunterapi
Summary
Den mest benyttede metode for generering av et stort antall autologe dendrittiske celler (DC) for anvendelse i tumor immunoterapi er beskrevet. Metoden bruker IL-4 og GM-CSF for å skille DCs fra monocytter. Umodne DC blir stimulert til å modne og deretter lastet med antigener før de blir injisert tilbake i pasienten.
Abstract
Mens kliniske studier har fastslått at antigen-lastet DC vaksiner er trygge og lovende behandling for svulster 1, forblir deres kliniske effekten skal etableres. Metoden er beskrevet nedenfor, utarbeidet i samsvar med Good Manufacturing Process (GMP) retningslinjer, er en optimalisering av de vanligste ex vivo forberedelse metode for å generere et stort antall utviklingsland for kliniske studier to.
Vår metode benytter syntetisk TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) for å stimulere DCs. Våre tidligere undersøkelser fastslår at Poly-ICLC er den mest potente individuell modning stimulans for humane DC som vurdert av en oppregulering av CD83 og CD86, induksjon av interleukin-12 (IL-12), tumornekrosefaktor (TNF), interferon gamma-indusert protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) og type I-interferoner (IFN), og den minimale interleukin 10 (IL-10)-produksjon. </p>
DCs er differensiert fra frosne perifere mononukleære celler (PBMCs) fremstilt ved leukaferese. PBMC blir isolert ved Ficoll-gradientsentrifugering, og frosset i alikvoter. På dag 1 blir PBMC tint og platet ut på vevskulturflasker å selektere for monocytter som festes til plastoverflaten etter 1-2 timers inkubasjon ved 37 ° C i vevskultur-inkubator. Etter inkubasjon blir lymfocyttene vasket av, og de adherente monocytter dyrkes i 5 dager i nærvær av interleukin-4 (IL-4) og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) for å differensiere til umodne DCS. På dag seks, er umodne DCs pulserende med Nøkkelhullet limpet hemocyanin (KLH) protein som fungerer som en kontroll for kvaliteten på vaksinen, og kan øke effekten av vaksinen tre. DCS blir stimulert til å modne, lastet med peptid antigener, og inkubert over natten. På dag 7 ble cellene vasket, og frosset i en ml alikvoter inneholdende4-20 x 10 6 celler ved hjelp av en kontrollert-rate fryser. Lot utgivelsen testing for de grupper av utviklingsland er utført og må oppfylle minimum spesifikasjoner før de blir injisert i pasienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fase I og II kliniske studier av blodmonocyttavledede DCs har vist at de indusere immunresponser hos pasienter imidlertid klinisk suksess har vært begrenset en. Dette kan delvis skyldes mangel på enighet om hvordan å generere de optimale DCs for svulst immunterapeutisk bruk. Selv om det er mange måter å generere klinisk grad DCS disse metodene varierer når det gjelder bruken av cytokiner som brukes til å differensiere monocytter er stimuleringen brukes til å indusere modningen og fremgangsmåter for a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Andres Salazar (Oncovir, Inc.) for gaven av Poly-ICLC.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. 암 연구학. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
