Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia
Summary
El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.
Abstract
Mientras que los estudios clínicos han establecido que las vacunas de DC cargadas con antígeno son seguros y prometedora terapia para los tumores 1, su eficacia clínica queda por establecer. El método descrito a continuación, preparado de conformidad con las Buenas Proceso de Fabricación (GMP) directrices, es una optimización del procedimiento de preparación ex vivo más común para la generación de un gran número de países en desarrollo para los estudios clínicos 2.
Nuestro método utiliza el TLR 3 agonista sintético poliinosínico-policitidílico Carboximetilcelulosa-ácido poli-L-lisina (poli-ICLC) para estimular los países en desarrollo. Nuestro estudio anterior estableció que poli-ICLC es el más potente estímulo de maduración individual para países en desarrollo humano según lo evaluado por una regulación positiva de CD83 y CD86, la inducción de la interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma inducida proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), y los interferones tipo I (IFN), y la interleucina mínima 10 (IL-10) de producción. </p>
Países en desarrollo se diferencian a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs congeladas) obtenidos por leucoféresis. PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y se congelaron en alícuotas. En el Día 1, las PBMC se descongelan y se sembraron en matraces de cultivo tisular para seleccionar para los monocitos que se adhieren a la superficie de plástico después de 1-2 horas de incubación a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido. Después de la incubación, los linfocitos se eliminan mediante lavado y los monocitos adherentes se cultivaron durante 5 días en presencia de interleucina-4 (IL-4) y el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) para diferenciar a los DC inmaduras. En el día 6, las DC inmaduras son pulsadas con la proteína hemocianina de lapa californiana (KLH), que sirve como control para la calidad de la vacuna y puede aumentar la inmunogenicidad de la vacuna 3. Los países en desarrollo son estimulados a madurar, cargados de antígenos de péptido, y se incubaron durante la noche. En el día 7, las células se lavaron, y se congelaron en alícuotas de 1 ml que contienen4-20 x 10 6 células usando un congelador de velocidad controlada. Pruebas de liberación del lote para los lotes de centros de datos se lleva a cabo y debe cumplir con las especificaciones mínimas antes de ser inyectadas en pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fase I y II de los ensayos clínicos de los DC derivadas de monocitos he demostrado que inducen la respuesta inmune en los pacientes sin embargo el éxito clínico ha sido limitado 1. Esto puede deberse en parte a la falta de consenso sobre la forma de generar los países en desarrollo óptimos para el uso de inmunoterapia tumoral. Aunque hay numerosas maneras de generar los DC de grado clínico, estos métodos varían en términos de la utilización de citoquinas usados para diferenciar los monocitos, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Andrés Salazar (Oncovir, Inc.) por el don de la poli-ICLC.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
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