Experimentelle Methoden zur Prüfung der Auswirkungen von Neurotrophic Peptide, ADNF-9, gegen den Alkohol-induzierte Apoptose während der Schwangerschaft in C57BL / 6 Mäuse
Summary
Die experimentellen Entwürfe hier vorgeschlagenen konzentrieren sich auf die Untersuchung der Auswirkungen von Alkohol-Exposition in der Apoptose und der Anwendung von neurotrophen Peptid während der Schwangerschaft in der fetalen Gehirns. Eine detaillierte Beschreibung aus der Zucht der Sammlung des fetalen Gehirns beschrieben. Techniken zur Bestimmung der Apoptose auch im Detail beschrieben.
Abstract
Experimentelle Designs für die Untersuchung der Auswirkungen einer pränatalen Exposition Alkohol während der frühen embryonalen Stadien der fetalen Hirnentwicklung sind anspruchsvoll. Dies ist vor allem auf die Schwierigkeit der Mikrodissektion des fetalen Gehirns und ihre Schnitte zur Bestimmung von apoptotischen Zellen durch pränatale Alkohol verursacht. Die hier beschriebenen Experimente stellen visualisiert Techniken Zucht von Mäusen zur Identifizierung von Zelltod in fötalen Hirngewebe. In dieser Studie wurden C57BL / 6 Mäuse als Tiermodell für die Untersuchung fetalen Alkohol-Exposition und die Rolle der trophischen Peptid gegen Alkohol-induzierte Apoptose. Die Zucht besteht aus einem 2-Stunden-Matten Fenster, um die genaue Stadium der embryonalen Alter zu bestimmen. Eine etablierte fetalen Alkohol-Exposition Modell wurde in dieser Studie verwendet worden, um die Auswirkungen einer pränatalen Exposition Alkohol in fetalen Gehirn zu bestimmen. Dies beinhaltet den freien Zugang zu Alkohol-oder Paar-fed flüssige Ernährung als die einzige Quelle von Nährstoffen für die schwangeren Mäusen.
<p class = "jove_content"> Die Techniken, die Dissektion der Föten und Mikrodissektion der fetalen Gehirne sind sorgfältig beschrieben, da letztere eine Herausforderung sein kann. Microdissection erfordert ein Stereomikroskop und ultra-feinen Pinzette. Schritt-für-Schritt-Verfahren zum Präparieren der fetalen Gehirne sind visuell zur Verfügung gestellt. Die fötalen Gehirn von der Basis des primordium Riechkolben der Basis des metencephalon seziert.Zur Untersuchung der Apoptose werden fetale Gehirn zuerst in Gelatine eingebettet mit einer Peel-away-Form, um ihre Schnitte mit einem Vibratom Gerät zu erleichtern. Fetal Gehirn eingebettet und in Paraformaldehyd fixiert sind leicht geschnitten und die frei schwebende Abschnitte in SuperFrost sowie Folien zur Bestimmung der Apoptose oder Zelltod zu montieren.
TUNEL (TdT-vermittelte dUTP Nick End Labeling; TdT: Desoxyribonukleotidyltransferase)-Assay wurde verwendet, um den Zelltod oder Apoptose Zellen zu identifizieren. Es ist bemerkenswert, dass apoptosis und zellvermittelte Zytotoxizität von DNA-Fragmentierung ist. Somit sind die visualisiert TUNEL-positiven Zellen anzeigt, Zelltod oder apoptotischen Zellen.
Die experimentellen Entwürfe hier Informationen über die Verwendung von einem etablierten flüssige Diät für die Untersuchung der Wirkung von Alkohol und die Rolle von neurotrophen Peptide während der Schwangerschaft in der fetalen Gehirns. Dies beinhaltet Zucht und Fütterung schwangeren Mäusen, microdissecting fetale Gehirn und Bestimmen Apoptose. Zusammen könnten diese visuellen und textlichen Techniken eine Quelle für die Untersuchung von pränatalen Exposition von schädlichen Substanzen in der fötalen Gehirn sein.
Introduction
Das Ziel der experimentellen hier beschriebenen Methoden ist es, die neuroprotektive Wirkung von trophischen Peptide in einer fetalen Alkohol-Exposition Modell mit mehreren Techniken, die Zucht zu beurteilen, Fütterung, microdissecting und Erfassen Zelltod. Arbeiten aus unserem Labor hat eine flüssige Diät mit Alkohol als ein Modell der moderate Alkoholkonsum, die ähnlich einem menschlichen trinken Paradigma in der Bezeichnung der Menge an Alkohol, vielleicht gemischt beteiligt verbraucht 1-5. Wir und andere haben drei Peptidderivate, die neuroprotektive gegen die schädlichen Wirkungen von fetalen Alkohol Exposition identifiziert. Studien, die Alkohol-Exposition während der embryonalen Stadien anhand von Tiermodellen kann zur Identifizierung von potentiellen Mechanismen der Neuroprotektion führen und damit für die Entwicklung von Interventionsstrategien Verfahren. Dies kann umfassende Informationen über die neuroprotektive Effekte und Abschwächung der schädlichen Auswirkungen von Alkohol während der Schwangerschaft.
Mögliche Prävention der Auswirkungen einer pränatalen Exposition Alkohol kann es sich um die Behandlung von schwangeren Mäusen mit Peptiden, die gezeigt haben, um bei der Neuroprotektion in vitro und in vivo 6,7 1,2,4,8,9 einbezogen werden. Unter dieser Peptide wird SALLRSIPA, wie ADNF-9 oder SAL bekannt, von Aktivitäts-abhängigen neurotrophen Faktor (ADNF) 7,10 abgeleitet. Ein weiteres Peptid mit der Sequenz NAPVSIPQ Peptid bezeichnet NAP von leistungsabhängige neuroprotektive Protein (ADNP) 6,11 abgeleitet ist, zeigte eine starke schützende Wirkung gegen oxidativen Stress mit Alkoholberührung 12,13 verbunden. Darüber hinaus haben wir vor kurzem eine neue synthetisierte Peptid, colivelin, die eine wichtige neuroprotektive Rolle in der fetalen Alkohol-Exposition Modell 2 zu spielen scheint identifiziert. Colivelin wird von ADNF-9 und AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP) zusammen. Die Bedeutung der Verwendung dieser Peptide ist, dass sie die Fähigkeit haben,überqueren die Blut-Hirn-Schranke, um die Auswirkungen von Alkohol-induzierten Apoptose und Gehirn Wachstum Defizite zu verhindern.
Die experimentellen Methoden C57BL / 6 Mäusen für die Prüfung der neuroprotektive Effekte gegen Alkohol-induzierte Apoptose. Wir haben einen 2-Stunden-Fenster statt über Nacht Zucht angenommen, um genau zu schätzen, die embryonalen Tag 0 (E0), wie es durch den Nachweis eines Spermiums Stecker und Vaginalabstrich 1-5 enthüllt werden kann. Wir haben eine flüssige Diät mit Magensonden eingesetzt, da dies als kostenlosen Zugang statt Lieferung von Alkohol durch eine Magensonde Route, die Stress schwangeren Mäusen induzieren kann. Auf der anderen Seite kann eine Herausforderung sein Mikrodissektion aufgrund der Weichheit des fötalen Hirngewebe, die auftreten, wenn Sezieren fetale Gehirn in frühen embryonalen Stadien werden könnte. Hier zeigen wir, visualisiert Techniken, um mit all den Herausforderungen, denen Mikrodissektion umzugehen. Da die fötalen Gehirn Schneiden kann auch schwierig sein, haben wir angenommeneine Technik, die die Einbettung der fetalen Gehirn in Gelatine mit Peel-away Einbettschälchen beinhaltet. Wir haben in Schneiden der fetalen Gehirn in frei schwebende Abschnitte bei 50 um Dicke erfolgreich. Dies ermöglicht es uns, alle Änderungen von Inhalten Protein im fötalen Gehirn Abschnitte untersuchen, einschließlich der Identifizierung von Zelltod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methodik und die Technologie in dieser Studie dargestellt sind, zeigen die Auswirkungen der pränatalen Exposition gegenüber Alkohol im fetalen Gehirn und die Rolle der trophischen Peptide bei der Prävention dieser Effekte. Diese können Informationen darüber, wie zu anderen Drogen oder andere giftige Chemikalien in der fötalen Gehirn während der verschiedenen Stadien der Schwangerschaft zu untersuchen.
In Bezug auf die Zucht Paradigma, in einigen Fällen ist die Erfassung der Sperm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Forschungsprojekt wurde von Verleihungsnummer R21AA017735 (YS) aus der National Institutes für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung des Autors und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute on Alkoholmissbrauch und Alkoholismus oder der National Institutes of Health. Der Autor möchte auch Charisse Montgomery für die Bearbeitung des Manuskripts danken.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. 신경과학. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. 신경과학. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. 신경과학. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
