모기 내장 Metagenomic RNA-seq에 대한 Ribosomal RNA의 고갈
Summary
ribosomal RNA (rRNA) 고갈 프로토콜은 모기 내장 metatranscriptome의 RNA-seq를위한 메신저 RNA를 (mRNA) 풍부하게하기 위해 개발되었습니다. 뺄셈을 통해 rRNA를 제거하는 데 사용 된 샘플 특정 rRNA 프로브은, 모기와 내장 미생물에서 만들어졌습니다. 프로토콜의 성능은 rRNA의 약 90~99%의 삭제 될 수 있습니다.
Abstract
모기 직감은 곤충의 생활주기의 다른 단계에 걸쳐 동적 미생물 커뮤니티를 수용 할 수 있습니다. 내장 커뮤니티의 유전 용량과 기능의 특성은 모기 삶의 특성에 내장 microbiota의 효과에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. Metagenomic RNA – Seq는 미생물 지역 사회에 존재하는 다양한 미생물에서 transcriptomes을 분석 할 수있는 중요한 도구가되었습니다. rRNA는 약 90 %를 구성하는 동안 메신저 RNA는 일반적으로, 총 RNA의 1-3 위에 만 %를 포함한다. 대부분의 prokaryotic mRNA 종은 안정 폴리 (A) 꼬리 부족 때문에 metagenomic 미생물 RNA 샘플에서 메신저 RNA를 풍부하게 도전하고 있습니다. 이 oligo D (T) 매개의 mRNA 절연을 방지합니다. 여기, 우리는 rRNA가 metagenomic 총 RNA 샘플에서 rRNA를 제거하는 프로브를 캡처 파생 샘플을 사용 프로토콜을 설명합니다. 시작하려면, 모기와 미생물의 크고 작은 subunit의 rRNA 조각 모두 metagenomic 지역 사회의 DNA 샘플에서 증폭됩니다. 그런 다음, community 특정 biotinylated 안티센스 RNA ribosomal 프로브는 T7 RNA 중합 효소의를 사용하여 체외에서 합성되어 있습니다. biotinylated rRNA 프로브는 총 RNA에 hybridized 있습니다. 하이브리드는 streptavidin – 코팅 구슬에 의해 캡처 된 총 RNA에서 제거됩니다. 이 빼기 기반 프로토콜을 효율적으로 전체 RNA 샘플에서 모기와 미생물 rRNA를 모두 제거합니다. mRNA 농축 샘플은 또한 RNA의 증폭 및 RNA-Seq에 처리됩니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 기술은 크게 분류 학적 조성과 미생물 조립의 유전자 기능을 평가 할 수 있도록하여 metagenomics 연구를 전진했다. RNA-시퀀싱 (RNA-Seq) 1 서로 다른 상황 2-5에서 미생물 metatranscriptomes를 조사 문화 기반 방법을 무시할 수 있습니다. prokaryotic mRNA 종은 안정적으로 polyadenylated되지 않으므로 미생물 RNA-seq에 대한 주요 장애물은 mRNA을 풍요롭게에 어려움이 있습니다. 따라서, oligo D (T) 매개 메신저 농축이 적용되지 않습니다. 풍부한 rRNA의 제거는 mRNA을 풍부하게 할 수있는 대안 방법입니다. 이러한 Microexpress 박테리아 mRNA 농축 키트 (Ambion), RiboMinus Transcriptome 절연 키트 (박테리아) (생명 기술), 그리고 우선적으로 exonuclease와 rRNA을 방해 mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA 절연 키트 (Epicentre)와 같은 상업 rRNA 고갈 키트는 사용되었다 rRNA 6-8를 제거하십시오. Microexpress에서 그러나, 캡처 프로브또는 RiboMinus은 (제조업체의 사양을 참조) 전형적인 그람 양성과 그람 음성 세균에서 알려진 rRNA를 제거에 좋은,하지만 알 수없는 미생물의 rRNA와 덜 호환됩니다. 따라서, 제거 metagenomic 샘플 8-10에 덜 효율적으로 할 수 있습니다. exonuclease 치료가 11을 적용했을 때 또, mRNA의 풍부한의 충실도 의심했다. 전반적으로, 뺄셈 기반 rRNA 고갈 적은 편견과 metagenomic 설정 10-13의 mRNA 농축에 더 효과적이었습니다.
모기 창자는 역동적 미생물 커뮤니티 14 숙박이 가능합니다. 우리는 RNA-Seq을 사용하여 모기 내장 microbiome의 기능을 특성화에 관심이 있습니다. 모기 내장 격리 RNA 샘플에서 모두 모기와 미생물의 RNA가 존재한다. 여기, 우리는 효율적으로 subtractive 하이브리드에 의해 모기와 미생물 rRNA를 고갈 지역 사회 특정 rRNA 프로브를 사용하는 수정 된 프로토콜을 설명합니다. 결과 mRNA농축 샘플 RNA-Seq에 적합합니다. 전체 흐름은 그림 1에 묘사되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
복잡한 미생물 커뮤니티는 모기 내장 생태계 14,16,17에 있습니다. Metatranscriptomic 시퀀싱 (RNA-seq)는 전체 미생물의 transcriptome 4,18을 조사하여 상황에 따라 기능 정보를 공개 할 수 있습니다. 기술적으로는, prokaryotic mRNA의 oligo-D (T) 매개 농축 인해 안정적인 폴리 메신저의 (A) 꼬리의 부재에 적용되지 않습니다. 또한, rRNA의 고갈은 mRNA 농축에 사용되었습니다. 여기, 우리는 모기 내장 미?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 1SC2GM092789-01A1에서 지원하고, MS는 NMSU 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 연구 프로그램의 연구 학자였습니다. 동영상이 감독 제작 에이미 Lanasa 의해 NMSU의 크리에이티브 미디어 연구소와 박사 필립 루이스에 의해 조정되었다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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