Udtømning af ribosomalt RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq
Summary
En ribosomalt RNA (rRNA) udtømning protokol blev udviklet til at berige messenger RNA (mRNA) for RNA-seq af myg tarmen metatranscriptome. Prøve specifikke rRNA prober, som blev brugt til at fjerne rRNA via subtraktion, blev skabt fra myg og dens tarm mikrober. Udførelsen af protokollen kan resultere i fjernelse af tilnærmelsesvis 90-99% af rRNA.
Abstract
Den myg gut rumme dynamiske mikrobielle samfund på tværs af forskellige stadier af insektets livscyklus. Karakterisering af den genetiske kapacitet og funktionalitet af tarmen samfund vil give indsigt i følgerne af tarmens mikrobiota om myg liv træk. Metagenomic RNA-Seq er blevet et vigtigt værktøj til at analysere transcriptomes fra forskellige mikrober til stede i en mikrobiel samfund. Messenger RNA omfatter sædvanligvis kun 1-3% af totalt RNA, mens rRNA udgør cirka 90%. Det er en udfordring at berige messenger-RNA fra en metagenomic mikrobiel RNA-prøve, fordi de fleste prokaryote mRNA-arter mangler stabile poly (A) haler. Dette forhindrer oligo d (T) medieret mRNA isolation. Her beskriver vi en protokol der anvender prøve afledt rRNA indfangningsprober til fjernelse af rRNA fra en metagenomic total RNA-prøve. Til at begynde, er både myg og mikrobielle små og store subunit rRNA-fragmenter amplificeret fra et metagenomic samfund DNA-prøve. Derefter kommunikatiskabets specifikke biotinylerede antisense ribosomale RNA-prober syntetiseres in vitro under anvendelse af T7 RNA-polymerase. De biotinylerede rRNA-prober hybridiseret til totalt RNA. Hybriderne indfanges af streptavidin-coatede beads og fjernes fra det totale RNA. Denne subtraktion-baseret protokol effektivt fjerner både myg og mikrobiel rRNA fra den totale RNA-prøve. MRNA'et beriget prøve yderligere forarbejdes for RNA-amplifikation og RNA-Seq.
Introduction
Næste generation sekventering teknologi har i høj grad avanceret metagenomet undersøgelse ved at tillade at vurdere taksonomiske sammensætning og genetisk funktionalitet af en mikrobiel assemblage. RNA-sekventering (RNA-Seq) 1 kan omgå kultur-baserede metoder til at undersøge mikrobielle metatranscriptomes i forskellige sammenhænge 2-5. En stor hindring for mikrobiel RNA-seq er vanskeligheden ved at berige mRNA, som de prokaryote mRNA-species der ikke er stabilt polyadenyleret. Derfor oligo d (T) medieret messenger berigelse finder ikke anvendelse. Fjernelse af rigelige rRNA er en alternativ fremgangsmåde til at berige mRNA. Kommercielle rRNA depletion kits, såsom Microexpress Bakteriel mRNA Enrichment kit (Ambion), RiboMinus transkriptom Isolation Kit (bakterier) (Life Technologies), og mRNA-ONLY Prokaryotisk mRNA Isolation kit (Epicentre), som fortrinsvis nedbrydes rRNA med en exonuclease, er blevet anvendt til fjernelse af rRNA 6-8. Men bindingsproberne i Microexpresseller RiboMinus er gode til at fjerne kendte rRNA fra typiske Gram-positive og Gram-negative bakterier (se fabrikantens specifikationer), men mindre kompatibel med rRNA fra ukendte mikrober. Derfor kan fjernelse være mindre effektiv for metagenomic prøver 8-10. Desuden mRNA overflod fidelity var tvivlsom, da exonukleasebehandling blev anvendt 11. Samlet subtraktion-baserede rRNA depletion var mindre forudindtaget og mere effektive i mRNA berigelse i metagenomic indstillinger 10-13.
Den myg gut rummer en dynamisk mikrobielle samfund 14. Vi er interesseret i at karakterisere funktionen af den myg tarmen microbiome ved hjælp af RNA-Seq. I en RNA-prøve isoleret fra de myg indvolde, er begge myg og mikrobielle RNA til stede. Her beskriver vi en modificeret protokol til at bruge community specifikke rRNA prober til effektivt nedbryder myg og mikrobiel rRNA ved subtraktiv hybridisering. Den resulterende mRNAberigede prøver er egnede til RNA-Seq. Den samlede arbejdsgang er afbildet i figur 1..
Protocol
Representative Results
Discussion
En kompleks mikrobielle samfund ligger i den myg tarmen økosystem 14,16,17. Metatranscriptomic sekventering (RNA-seq) kan afsløre kontekstafhængige funktionel information ved at udspørge hele mikrobielle transkriptomet 4,18. Teknisk, oligo-d (T) medieret berigelse af prokaryotisk mRNA er ikke anvendelig på grund af fraværet af stabile poly (A) haler budbringere. Alternativt er rRNA depletion blevet anvendt til mRNA berigelse. Her har vi udviklet en subtraktion-baseret protokol til nedbryder r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 1SC2GM092789-01A1, og MS var et forsknings lærd af NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate forskningsprogrammer. Videoen blev instrueret og produceret af Amy Lanasa og koordineret af Dr. Philip Lewis med Creative Media Institut på NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
