Uitputting van ribosomaal RNA voor Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq
Summary
Een ribosomaal RNA (rRNA) uitputting protocol werd ontwikkeld om messenger RNA (mRNA) voor RNA-seq van de mug darm metatranscriptome verrijken. Voorbeeld specifieke rRNA probes die werden gebruikt om rRNA verwijderen via aftrekcircuit werden gemaakt van de mug en gut microben. Uitvoering van het protocol kan resulteren in de verwijdering van ongeveer 90-99% van rRNA.
Abstract
De mug darm herbergt dynamische microbiële gemeenschappen in de verschillende stadia van het leven van het insect cyclus. Karakterisering van de genetische capaciteit en functionaliteit van de darm gemeenschap zal inzicht geven in de effecten van darmflora op muggen leven kenmerken. Metagenomic RNA-Seq is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om transcriptomen analyseren van verschillende microben aanwezig zijn in een microbiële gemeenschap. Messenger RNA omvat gewoonlijk slechts 1-3% van de totale RNA, terwijl rRNA vormt ongeveer 90%. Het is een uitdaging om boodschapper-RNA verrijken van een metagenomic microbiële RNA-monster omdat de meeste prokaryote mRNA-soorten ontbreken stabiel poly (A) staarten. Dit voorkomt oligo d (T) gemedieerde mRNA isolatie. We beschrijven een protocol dat monster afkomstig rRNA invangprobes van rRNA uit een metagenomic totaal RNA monster werken. Om te beginnen, zijn beide mug en microbiële kleine en grote subeenheid rRNA fragmenten geamplificeerd uit een metagenomic gemeenschap DNA-monster. Vervolgens wordt de communicatieschap specifieke gebiotinyleerde antisense ribosomaal RNA probes worden gesynthetiseerd in vitro met T7 RNA polymerase. De gebiotinyleerde rRNA probes worden gehybridiseerd met het totale RNA. De hybriden worden gevangen door streptavidine-gecoate parels en uit het totale RNA. Deze aftrekken gebaseerd protocol verwijdert efficiënt zowel mug en microbiële rRNA van de totale RNA-monster. De mRNA verrijkte monster wordt verder verwerkt voor RNA amplificatie en RNA-Seq.
Introduction
Next-generation sequencing technologie is sterk gevorderd metagenomica studie door het mogelijk maakt om de taxonomische samenstelling en genetische functionaliteit van een microbiële assemblage te beoordelen. RNA-Sequencing (RNA-Seq) 1 kan omzeilen cultuur-gebaseerde methoden om de microbiële metatranscriptomes onderzoeken in verschillende contexten 2-5. Een belangrijk obstakel voor microbiële RNA-seq de moeilijkheid verrijken mRNA, de mRNA prokaryotische species niet stabiel gepolyadenyleerd. Daarom oligo d (T) gemedieerde messenger verrijking niet van toepassing. Het verwijderen van overvloedige rRNA is een alternatieve benadering om mRNA te verrijken. Commercieel rRNA uitputting kits zoals Microexpress Bacterial mRNA Enrichment kit (Ambion) RiboMinus Transcriptome Isolation Kit (Bacteria) (Life Technologies) en mRNA-ONLY Prokaryote mRNA Isolation kit (Epicentre) die bij voorkeur rRNA degradeert met een exonuclease, zijn gebruikt voor het verwijderen rRNA 6-8. De capture probes in Microexpressof RiboMinus zijn goed voor verwijderen van bekende rRNA van typische Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën (zie fabrikant specificatie), maar minder geschikt rRNA van onbekende microben. Bijgevolg kan de verwijdering minder efficiënt voor metagenomic monsters 8-10. Naast de mRNA overvloed fidelity twijfelachtig bij de exonuclease behandeling werd toegepast 11. Overall, aftrekken op basis van rRNA uitputting was minder bevooroordeeld en meer effectief in het mRNA verrijking in metagenomic instellingen 10-13.
De mug darm herbergt een dynamische microbiële gemeenschap 14. We geïnteresseerd in het karakteriseren van de functie van de mug darm microbiome met RNA-Seq. In een RNA-monster geïsoleerd van de mug lef, zowel mug en microbiële RNA aanwezig zijn. Hier beschrijven we een aangepast protocol om de gemeenschap specifieke rRNA sondes gebruiken om muggen en microbiële rRNA efficiënt uitputten door subtractieve hybridisatie. De resulterende mRNAverrijkte monsters geschikt zijn voor RNA-Seq. De algemene werkwijze wordt weergegeven in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een complexe microbiële gemeenschap leeft in de mug darm ecosysteem 14,16,17. Metatranscriptomic sequencing (RNA-seq) kan onthullen contextafhankelijk functionele informatie door het ondervragen van de gehele microbiële transcriptoom 4,18. Technisch oligo-d (T) gemedieerde verrijking van mRNA prokaryotische niet toepasbaar omdat de afwezigheid van stabiele poly (A) staarten van de boodschappers. Alternatief is rRNA depletie gebruikt voor mRNA verrijking. Hier hebben we een aftrekking-gebaseerd pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie 1SC2GM092789-01A1, en MS was een onderzoek geleerde van NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate Research Programma's. De video werd geregisseerd en geproduceerd door Amy Lanasa en gecoördineerd door dr. Philip Lewis met de Creative Media Instituut in NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
