मच्छर आंत Metagenomic आरएनए - seq के लिए ribosomal शाही सेना की कमी
Summary
एक ribosomal शाही सेना (rRNA) रिक्तीकरण प्रोटोकॉल आरएनए – seq मच्छर पेट metatranscriptome के लिए दूत शाही सेना (mRNA) को समृद्ध करने के लिए विकसित किया गया था. नमूना विशिष्ट rRNA जांच, जो घटाव के माध्यम से rRNA निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया, मच्छर और उसके आंत रोगाणुओं से बनाया गया था. प्रोटोकॉल के प्रदर्शन rRNA का लगभग 90-99% के हटाने में परिणाम कर सकते हैं.
Abstract
मच्छर पेट कीट के जीवन चक्र के विभिन्न चरणों के पार गतिशील माइक्रोबियल समुदायों accommodates. आनुवंशिक और पेट समुदाय की क्षमता कार्यक्षमता की विशेषता मच्छर जीवन के लक्षण पर पेट microbiota के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. Metagenomic शाही सेना Seq एक माइक्रोबियल समुदाय में उपस्थित विभिन्न रोगाणुओं से transcriptomes का विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. दूत शाही सेना आमतौर पर केवल कुल शाही सेना का 1-3% शामिल हैं, जबकि rRNA लगभग 90% का गठन किया है. यह एक metagenomic माइक्रोबियल शाही सेना के नमूने से दूत शाही सेना को समृद्ध चुनौती दे रहा है, क्योंकि सबसे prokaryotic mRNA प्रजातियों स्थिर पाली (ए) की पूंछ की कमी. यह oligo घ (टी) मध्यस्थता mRNA अलगाव से बचाता है. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि व्युत्पन्न rRNA जांच पर कब्जा करने के लिए एक metagenomic कुल शाही सेना नमूना से rRNA हटाने नमूना रोजगार का वर्णन. शुरू करने के लिए, दोनों मच्छर और माइक्रोबियल छोटे और बड़े सबयूनिट rRNA टुकड़े एक metagenomic समुदाय डीएनए नमूने से परिलक्षित कर रहे हैं. फिर, समुदायसामुदायिक विशिष्ट biotinylated antisense ribosomal शाही सेना जांच T7 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर इन विट्रो में संश्लेषित कर रहे हैं. biotinylated rRNA जांच कुल शाही सेना के लिए कर रहे hybridized. संकर streptavidin लिपटे मोतियों के द्वारा कब्जा कर रहे हैं और कुल शाही सेना से हटा दिया. कुशलतापूर्वक इस घटाव आधारित प्रोटोकॉल दोनों और माइक्रोबियल rRNA कुल शाही सेना नमूना से मच्छर को हटा. mRNA समृद्ध नमूना आगे आरएनए प्रवर्धन और आरएनए Seq के लिए कार्रवाई की है.
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी बहुत वर्गीकरण संबंधी संरचना और एक सूक्ष्म संयोजन के आनुवंशिक कार्यक्षमता का आकलन करने की अनुमति देकर metagenomics अध्ययन उन्नत. आरएनए (आरएनए Seq) अनुक्रमण 1 संस्कृति आधारित तरीकों को बायपास करने के लिए अलग अलग संदर्भों 2-5 में माइक्रोबियल metatranscriptomes की जांच कर सकते हैं. माइक्रोबियल आरएनए – seq के लिए एक प्रमुख बाधा समृद्ध बनाने के mRNA में कठिनाई है, के रूप में prokaryotic mRNA प्रजातियों stably polyadenylated नहीं कर रहे हैं. इसलिए, oligo घ (टी) मध्यस्थता दूत संवर्धन लागू नहीं है. प्रचुर मात्रा rRNA हटाने mRNA को समृद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है. Microexpress बैक्टीरियल mRNA संवर्धन किट (Ambion), RiboMinus Transcriptome अलगाव किट (बैक्टीरिया) (जीवन टेक्नोलॉजीज), और mRNA केवल prokaryotic mRNA अलगाव (Epicentre) किट कि preferentially एक exonuclease साथ rRNA degrades जैसे वाणिज्यिक rRNA रिक्तीकरण किट, इस्तेमाल किया गया है 6-8 rRNA को हटाने के लिए. हालांकि, Microexpress में कब्जा जांचया RiboMinus ठेठ ग्राम पॉजिटिव और ग्राम – निगेटिव बैक्टीरिया से ज्ञात rRNA (निर्माताओं विनिर्देशों देखें) को हटाने के लिए अच्छा है, लेकिन अज्ञात रोगाणुओं से कम rRNA के साथ संगत कर रहे हैं. नतीजतन, हटाने metagenomic नमूने 8-10 के लिए कम कुशल हो सकता है. इसके अलावा, mRNA बहुतायत निष्ठा संदिग्ध था जब exonuclease उपचार 11 में लागू किया गया था. कुल मिलाकर, घटाव आधारित rRNA रिक्तीकरण है कम पक्षपाती और अधिक metagenomic 10-13 सेटिंग्स में mRNA संवर्धन में प्रभावी था.
मच्छर पेट एक गतिशील माइक्रोबियल समुदाय 14 accommodates. हम मच्छर आंत microbiome की शाही सेना Seq का उपयोग करके समारोह निस्र्पक में रुचि रखते हैं. एक शाही सेना मच्छर हिम्मत से अलग नमूने में, दोनों मच्छर और माइक्रोबियल शाही सेना मौजूद हैं. यहाँ, हम समुदाय विशिष्ट rRNA जांच का उपयोग करने के लिए कुशलतापूर्वक subtractive संकरण द्वारा मच्छर और माइक्रोबियल rRNA व्यय के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. परिणामी mRNAसमृद्ध नमूने शाही सेना Seq के लिए उपयुक्त हैं. समग्र कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दर्शाया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक जटिल माइक्रोबियल समुदाय मच्छर पेट 14,16,17 पारिस्थितिकी तंत्र में रहता है. Metatranscriptomic अनुक्रमण (आरएनए – seq) पूरे माइक्रोबियल transcriptome 4,18 पूछताछ संदर्भ निर्भर कार्यात्मक जानकारी प्रकट कर सकते हैं. तकनीकी ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH 1SC2GM092789 01A1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और एमएस हावर्ड NMSU ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूशन अंडर अनुसंधान कार्यक्रम के एक अनुसंधान विद्वान था. वीडियो का निर्देशन किया है और उत्पादन किया गया था और एमी Lanasa द्वारा क्रिएटिव मीडिया संस्थान के साथ NMSU में डॉ. फिलिप लुईस द्वारा समन्वित.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
