モスキートガットメタゲノムRNA-seqのためのリボソームRNAの枯渇
Summary
リボソームRNA（rRNA）の枯渇プロトコルは蚊腸metatranscriptomeのRNA-seqのためのメッセンジャーRNA（mRNA）を豊かにするために開発されました。引き算を介しrRNAを除去するために使用されたサンプル特定のrRNAプローブは、蚊とその腸内微生物から作成されています。プロトコルのパフォーマンスは、rRNAの約90から99パーセントの除去をもたらすことができます。
Abstract
蚊の腸は昆虫のライフサイクルのさまざまな段階でダイナミック微生物群集を収容する。腸コミュニティの遺伝能力と機能の特徴づけは、蚊生活特性に及ぼす腸内細菌叢に及ぼす影響への洞察を提供します。メタゲノムRNA-Seqは微生物群集中に存在する様々な微生物からトランスクリプトームを解析するための重要なツールとなっている。 rRNAは約90％を占めながら、メッセンジャーRNAは通常、全RNAのわずか百分の1から3を備えている。それは、ほとんどの原核生物のmRNA種が安定してポリ（A）尾部を欠いているため、メタゲノム微生物RNAサンプルからメッセンジャーRNAを豊かにするために挑戦している。これは、オリゴd（T）媒介mRNA分離を防ぐことができます。ここでは、メタゲノムトータルRNAサンプルからrRNAを除去するためにrRNAの捕獲プローブ由来の試料を用いてプロトコルを記述します。開始するには、両方の蚊と微生物、大小のサブユニットrRNAの断片は、メタゲノムコミュニティのDNAサンプルから増幅されています。その後、コミュnity特異的なビオチン化アンチセンスリボソームRNAプローブは、T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitro で合成される。ビオチン化されたrRNAのプローブは、全RNAにハイブリダイズさせる。ハイブリッドは、ストレプトアビジンコートビーズによって捕獲され、全RNAから削除されます。この減算ベースのプロトコルでは、効率的にtotal RNAサンプルから蚊や微生物rRNAの両方を削除します。 mRNAを濃縮試料をさらにRNA増幅およびRNA – seqのために処理される。
Introduction
次世代シーケンシング技術は大きく分類学的組成や微生物集団の遺伝的機能を評価できるようにすることで、メタゲノム研究を進めてきた。 RNA-シーケンシング（RNA-seq）が1は、異なる文脈2-5に微生物metatranscriptomesを調査するために、培養ベースのメソッドをバイパスすることができます。原核生物のmRNA種を安定的ポリアデニル化されていないため、微生物のRNA-seqの大きな障害とは、mRNAを濃縮することが困難であることである。したがって、オリゴd（T）媒介メッセンジャー濃縮は適用されません。豊富なrRNAの除去は、mRNAを豊かにするための代替的なアプローチです。そのようなMicroexpress細菌のmRNA濃縮キット（Ambion）、RiboMinusトランアイソレーションキット（細菌）（Life Technologies）を、優先的エキソヌクレアーゼでrRNAを劣化させるのmRNA-ONLY原核mRNAアイソレーションキット（エピセンター）などの商業rRNAの枯渇キットは、使用されてきたrRNAの6-8を取り除くため。 Microexpressでしかし、捕捉プローブまたはRiboMinusは未知の微生物から典型的なグラム陽性菌およびグラム陰性菌から知られているrRNAを除去するための良い（メーカーの仕様を参照してください）が、リボソームRNAとの互換性に欠けています。その結果、除去はメタゲノムサンプル8-10にはあまり効率的であるかもしれません。エキソヌクレアーゼ処理が11を塗布した場合に加えて、mRNA存在量の忠実度には疑問だった。全体的に、減算ベースrRNAの枯渇がより少ないバイアスとメタゲノムの設定10-13のmRNAの濃縮度のより効果的であった。
蚊の腸はダイナミック微生物群集14が収容されている 。我々は、RNA-Seqを使って蚊腸microbiomeの機能を特徴付けることに興味を持っています。蚊の根性から単離されたRNAサンプルでは、蚊や微生物RNAの両方が存在している。ここでは、効率的にサブトラクティブハイブリダイゼーションにより、蚊や微生物rRNAを除去するために、地域社会固有のrRNAのプローブを使用するように修正されたプロトコルを記述します。得られたmRNA濃縮されたサンプルは、RNA – seqのに適しています。ワークフロー全体を図1に描かれている。
Protocol
Representative Results
Discussion
複雑な微生物群集は、蚊の腸内生態系14,16,17に格納されています。 Metatranscriptomicシング（RNA-seq）は全体の微生物のトランスクリプトーム4,18を問い合わせることによってコンテキスト依存機能情報を明らかにすることができます。技術的には、原核生物のmRNAのオリゴd（T）媒介濃縮が原因でメッセンジャーの安定したポリ（A）尾の不在には適用されません。別の方法として、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの助成金1SC2GM092789-01A1でサポートされており、MSはNMSUハワードヒューズ医学研究所学部研究プログラムの研究学者だった。ビデオは監督と生産エイミーLanasaによってとNMSUのクリエイティブメディア研究所で博士フィリップ·ルイスによってコーディネートされた。
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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