Esgotamento de RNA ribossômico para metagenomico Gut Mosquito RNA-seq
Summary
A ribosomal RNA protocolo de depleção (rRNA) foi desenvolvido para enriquecer o RNA mensageiro (mRNA) de RNA-seq do intestino metatranscriptome mosquito. Sondas de amostras específicas rRNA, que foram usados para remover rRNA via subtração, foram criados a partir do mosquito e seus micróbios intestinais. Desempenho do protocolo pode resultar na remoção de aproximadamente 90-99% do rRNA.
Abstract
O intestino do mosquito acomoda comunidades microbianas dinâmicas em diferentes estágios do ciclo de vida do inseto. Caracterização da capacidade genética e funcionalidade da comunidade intestino irá fornecer informações sobre os efeitos da microbiota intestinal em traços de vida do mosquito. Metagenomico RNA-Seq tornou-se uma importante ferramenta para analisar transcriptomas de micróbios vários presentes em uma comunidade microbiana. RNA mensageiro compreende geralmente apenas 1-3% de ARN total, enquanto rRNA constitui cerca de 90%. É um desafio para o enriquecimento de RNA mensageiro a partir de uma amostra de metagenômico microbiana RNA pois a maioria das espécies de ARNm procariótico falta estáveis poli (A) tails. Isto evita que o oligo d (T) de isolamento de mRNA mediada. Aqui, nós descrevemos um protocolo que emprega amostra derivada de rRNA capturar sondas para remover rRNA a partir de uma amostra de RNA metagenômico total. Para começar, os dois fragmentos de mosquito e microbianas rRNA pequenas e grandes subunidades são amplificados a partir de uma amostra de DNA metagenômico comunidade. Então, a comunicaçãonitárias específicas biotinilados anti-sentido de sondas de RNA ribossomal são sintetizados in vitro usando T7 ARN-polimerase. As sondas biotiniladas rRNA são hibridizadas para o RNA total. Os híbridos são capturados por esferas revestidas com estreptavidina e removido a partir do ARN total. Este protocolo de subtração baseada remove eficientemente tanto mosquito e rRNA microbiano a partir da amostra de RNA total. O mRNA da amostra enriquecida é adicionalmente processado para o ARN e amplificação de RNA-Seq.
Introduction
Próxima geração de tecnologia de seqüenciamento tem muito avançado estudo metagenômica, permitindo avaliar a composição taxonômica e funcionalidade genética de um conjunto microbiana. RNA-Sequencing (RNA-Seq) 1 pode ignorar os métodos baseados em cultura para investigar metatranscriptomes microbianas em 2-5 contextos diferentes. Um dos principais obstáculos à microbiana RNA-seq é a dificuldade no enriquecimento do mRNA, como as espécies de ARNm procariótico não são estavelmente polyadenylated. Portanto, oligo d (T) enriquecimento mensageiro mediada não é aplicável. Remoção de rRNA abundante é uma abordagem alternativa para o enriquecimento de mRNA. Kits comerciais de depleção de rRNA, tais como kit Enriquecimento bacteriana mRNA Microexpress (Ambion), RiboMinus Isolation Kit Transcriptoma (bactérias) (Life Technologies), e-mRNA Isolation kit APENAS Prokaryotic mRNA (Epicentre) que preferencialmente degrada rRNA com uma exonuclease, têm sido usados para a remoção de rRNA 6-8. No entanto, as sondas de captura em Microexpressou RiboMinus são bons para a remoção de rRNA a partir de conhecido típicos bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (ver as especificações dos fabricantes), mas menos compatível com o rRNA de micróbios desconhecidos. Por conseguinte, a remoção pode ser menos eficiente para 8-10 metagenoma amostras. Além disso, a fidelidade abundância de ARNm era questionável, quando o tratamento com exonuclease foi aplicado 11. No geral, subtração baseada esgotamento rRNA foi menos tendencioso e mais eficaz no enriquecimento de mRNA em ambientes metagenômico 10-13.
O intestino do mosquito acomoda uma comunidade microbiana dinâmica 14. Estamos interessados em caracterizar a função do intestino microbiome mosquito usando RNA-Seq. Numa amostra de RNA isolado a partir dos intestinos de mosquitos, ambos os ARN de mosquito e microbianos estão presentes. Aqui, descrevemos um protocolo modificado para usar sondas específicas da comunidade rRNA de forma eficiente esgotar rRNA mosquito e microbiana por hibridização subtrativa. O mRNA resultanteamostras enriquecidas são apropriados para RNA-Seq. O fluxo de trabalho geral é mostrada na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A comunidade microbiana complexa reside no ecossistema estômago do mosquito 14,16,17. Metatranscriptomic seqüenciamento (RNA-seq) pode revelar informações dependente do contexto funcional interrogando o microbiana todo transcriptoma 4,18. Tecnicamente, oligo-d enriquecimento (T) de mRNA mediada procariótico não é aplicável devido à ausência de poli estáveis (A) tails dos mensageiros. Alternativamente, a depleção de rRNA foi usado para o enriquecimento de mRNA. Aqui, foi desenvolv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão 1SC2GM092789-01A1, e MS era um estudioso de pesquisa de NMSU Médico Howard Hughes Instituição Programas de Pesquisa de Graduação. O vídeo foi dirigido e produzido por Amy Lanasa e coordenado pelo Dr. Philip Lewis com o Creative Media Institute NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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