Истощение рибосомальной РНК для Mosquito метагеномных Gut РНК-сл
Summary
Рибосомной РНК (рРНК) истощение протокол был разработан для обогащения РНК (мРНК), РНК-след от комаров metatranscriptome кишечника. Примеры специфических зондов рРНК, которые были использованы для удаления рРНК через вычитание, были созданы из комара и его микробами кишечника. Выполнение протокола может привести к удалению примерно 90-99% рРНК.
Abstract
Кишечнике комара вмещает динамической микробных сообществ на различных этапах жизненного цикла насекомого. Характеристика генетического потенциала и функциональности кишечника сообщество обеспечит понимание последствий кишечник микрофлоры на комаров черты жизни. Метагеномных РНК-Seq стала важным инструментом для анализа transcriptomes от различных микробов, присутствующих в микробного сообщества. РНК обычно содержит всего 1-3% от общего числа РНК, а РНК составляет около 90%. Это является сложной задачей для обогащения РНК из образцов метагеномных микробной РНК, потому что большинство видов мРНК прокариот отсутствует стабильная поли (А) хвост. Это предотвращает олиго D (T) опосредованное мРНК изоляции. Здесь мы описываем протокол, который использует образцы, полученные рРНК захвата зонда для удаления рРНК из метагеномных общей выборке РНК. Для начала, как комар и микробных мелких и крупных фрагментов субъединицы рРНК усиливаются от метагеномных образца ДНК сообщества. Тогда, коммубесконечности конкретных биотинилированного антисмысловых рибосомных РНК-зондов синтезированы в пробирке использованием T7 РНК-полимеразы. Биотинилированные зонды рРНК гибридизуют к общей РНК. Гибридов захвачен покрытых стрептавидином шарики и удалить из общей РНК. Это вычитание протокола на основе эффективно удаляет как комар и микробных рРНК из общей выборки РНК. Образец мРНК обогащенный дальнейшей обработке для усиления РНК и РНК-Seq.
Introduction
Следующее поколение технологии секвенирования значительно продвинулись метагеномика исследования, позволяющие оценить таксономического состава и генетической функциональности микробной сборки. РНК-последовательности (РНК-Seq) 1 может обойти культуры на основе методов для исследования микробных metatranscriptomes в различных контекстах 2-5. Основным препятствием к микробной РНК-след является трудность в обогащении мРНК, как прокариотических видов мРНК не стабильно полиаденилированных. Таким образом, олиго D (T) опосредованное посланник обогащения не применяется. Удаление обильные рРНК является альтернативным подходом к обогащению мРНК. Коммерческая истощения рРНК комплекты, такие как бактериальный комплект Microexpress обогащению мРНК (Ambion), RiboMinus транскриптома изоляции Kit (бактерии) (Life Technologies), и мРНК-ONLY Прокариотические комплект изоляции мРНК (Эпицентр), которые преимущественно деградирует рРНК с экзонуклеаза, были использованы для удаления рРНК 6-8. Тем не менее, захват зондов в Microexpressили RiboMinus хорошо для удаления известных рРНК из типичных грамположительных и грамотрицательных бактерий (см. технические характеристики производителей), но меньше, совместимый с рРНК от неизвестных микробов. Следовательно, удаление может быть менее эффективным для метагеномных 8-10 образцов. Кроме того, верности мРНК изобилие была сомнительной, когда экзонуклеаза лечения был применен 11. В целом, вычитание на основе рРНК истощения была менее предвзято и более эффективным в мРНК обогащения в метагеномных настройки 10-13.
Кишечнике комара вмещает динамической микробного сообщества 14. Мы заинтересованы в том характеризующих функцию комаров микробиомом кишечника с помощью РНК-Seq. В образце РНК изолирован от комаров кишки, как комар и микробной РНК присутствуют. Здесь мы описываем изменения протокола, используемого сообщества специфических зондов рРНК эффективно разрушают комаров и микробных рРНК субтрактивный гибридизации. Полученные мРНКобогащенной образцы подходят для РНК-Seq. В целом рабочий процесс изображен на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Комплекс микробного сообщества находится в кишечнике комара экосистемы 14,16,17. Metatranscriptomic секвенирования (RNA-след) может выявить зависит от контекста функциональной информации путем опроса всей микробной транскриптом 4,18. Технически, олиго-D (T) опосредованное обогащения прок?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грант 1SC2GM092789-01A1 и MS было исследование ученый NMSU Howard Hughes Medical учреждение Бакалавриат исследовательских программ. Видео был режиссером и продюсером Эми Lanasa и координируется д-р Филип Льюис с Creative Media института NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Xie, W., et al. Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance. PLoS One. 7, e35181 (2012).
- Xie, L., et al. Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system. Genomics. 99, 246-255 (2012).
- Gosalbes, M. J., et al. Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota. PLoS One. 6, e17447 (2011).
- Urich, T., et al. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome. PLoS One. 3, e2527 (2008).
- Gilbert, J. A., et al. Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities. PLoS One. 3, e3042 (2008).
- Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome. ISME J. 5, 461-472 (2011).
- Poretsky, R. S., et al. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).
- Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities. Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).
- Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. Extraction of mRNA from soil. Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).
- He, S., et al. Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics. Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).
- Pang, X., et al. Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method. Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).
- Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, 896-907 (2010).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PLoS One. 6, e24767 (2011).
- Su, C., Sordillo, L. M. A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA. Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).
- Gusmao, D. S., et al. Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut. Acta Trop. 115, 275-281 (2010).
- Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. 16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).
- Simon, C., Daniel, R. Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).
- Wang, Y., Qian, P. Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS One. 4, e7401 (2009).
- Hunt, D. E., et al. Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).
