Wir präsentieren ein Protokoll zum Einfrieren und Kryoschneiden Hefe Gemeinden internen Muster der fluoreszierenden Zellen zu beobachten. Die Methode beruht auf Methanol-Fixierung und OCT-Einbettung, um die räumliche Verteilung der Zellen ohne Inaktivierung fluoreszierende Proteine innerhalb einer Gemeinschaft bewahren.
Abstract
Mikroben leben typischerweise in den Gemeinden. Die räumliche Organisation von Zellen innerhalb einer Gemeinschaft wird angenommen, dass das Überleben und die Funktion der Reisenden 1 auswirken. Optische Schnitte Techniken, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, haben sich bewährt zur Beobachtung räumlichen Organisation von Bakterien und Archaeen Gemeinden 2,3. Eine Kombination von konfokale Bildgebung und physikalische Schnitte von Hefe-Kolonien hat interne Organisation von Zellen 4 enthüllt. Allerdings hat direkte optische Schnitte mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie war nur in der Lage, ein paar Zellschichten tief in Hefe-Kolonien zu erreichen. Diese Einschränkung ist aufgrund der starken Streuung des Lichts aus Hefezellen 4 wahrscheinlich.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Festsetzung und Kryoschneiden die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen in Saccharomyces cerevisiae Gemeinden zu basieren. Wir verwenden Methanol als Fixiermittelum die räumliche Verteilung der Zellen zu erhalten. Feste Gemeinden sind mit OCT-Verbindung, gefroren und kryogeschnitten in einem Kryostaten infiltriert. Fluoreszenz-Bildgebung der Abschnitte zeigt die interne Organisation der fluoreszierenden Zellen innerhalb der Gemeinschaft.
Beispiele von Hefe Communities bestehend aus Stämmen exprimierenden rot und grün fluoreszierende Proteine zeigen die Potentiale des Kryoschneiden Methode, um die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen sowie die der Genexpression innerhalb Hefekolonien 2,3 offenbaren. Obwohl unsere Fokussierung auf Saccharomyces cerevisiae Gemeinden gewesen ist, kann das gleiche Verfahren angewandt potentiell zu anderen mikrobiellen untersuchen.
Protocol
Ein. Befestigung Hefe Gemeinschaften Wachsen Hefe Gemeinden auf einem Membranfilter (zB Millipore MF Membranfilter; 2A). Dieses Protokoll entspricht einer typischen Gemeinschaft von weniger als 2×10 8 Zellen auf einer 6 mm-Durchmesser-Membranfilter. Mit einem Stück Whatman 541 Filterpapier, um den Boden eines 1 cm Durchmesser und (2B) abzudecken. Diese Whatman Papier als Träger, um die Gemeinschaft in späteren Stadien übertragen werden. 1 ml …
Representative Results
Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitten von Hefe Communities enthaltenden roten und grün-tagged wettbewerbsfähigen Populationen 6 sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Gemeinschaften bestehen aus zwei prototrophen Hefestämme und deren Wettbewerb für gemeinsam genutzte Ressourcen, einschließlich Raum, führt zu säulenartigen Strukturen 7, wie in ihrer vertikalen Querschnitten dargestellt. Auflösungen bis hinunter zu einer einzigen Zelle kann in Querschnitten gelöst w…
Discussion
Das hier vorgestellte Verfahren bietet eine Möglichkeit, die innere Struktur des Hefe-Communities zu inspizieren. Das Methanol Fixierschritt macht die Hefekolonie starren 8 und bewahrt die Integrität der Kolonie, aber es verursacht auch Schrumpfung 8, sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Wir in der Regel sehen rund 30% Schrumpfung in Höhe von Hefe-Kolonien im Vergleich zu Kolonien direkt in OCT ohne Befestigungsmaterial 9 eingebettet.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Jonathan Cooper Lab am Fred Hutchinson Cancer Research Center für die Erlaubnis, ihre Kryostat verwenden danken. Diese Arbeit wurde vom NIH und der WM Keck Foundation unterstützt. BM ist ein Gordon und Betty Moore Fellow Life Science Research Foundation. Wir sind dankbar, dass Daniel Gottschling für die gemeinsame Nutzung seiner Befestigung Protokoll mit uns.