Cryosectioning Gjær Communities for å undersøke Fluorescens Patterns
Summary
Vi presenterer en protokoll for frysing og cryosectioning gjær samfunn for å observere interne mønstre av fluorescerende celler. Metoden baserer seg på metanol-innfesting og OCT-innebygging for å bevare den romlige fordelingen av celler uten å inaktivere fluorescerende proteiner i et fellesskap.
Abstract
Mikrober vanligvis lever i lokalsamfunn. Den romlige organisering av celler innenfor et fellesskap antas å påvirke overlevelse og funksjon av fellesskap 1. Optiske seksjonering teknikker, inkludert confocal og to-foton mikroskopi, har vist seg nyttig for å observere romlige organiseringen av bakterie-og archaeal samfunn 2,3. En kombinasjon av confocal avbildning og fysisk seksjonering av gjær kolonier har avdekket interne organiseringen av celler 4. Imidlertid har direkte optisk seksjonering hjelp confocal eller to-foton mikroskopi vært bare i stand til å nå et par cellelagene dypt inn gjær koloniene. Denne begrensningen er sannsynlig på grunn av sterk spredning av lys fra gjærceller 4.
Her presenterer vi en metode basert på å fikse og cryosectioning å få romlige fordelingen av fluorescerende celler innenfor Saccharomyces cerevisiae lokalsamfunn. Vi bruker metanol som fiksativ middelå bevare den romlige fordelingen av celler. Faste samfunn er infiltrert med oktober sammensatte, frossen, og cryosectioned i en kryostaten. Fluorescens avbildning av seksjonene avslører den interne organiseringen av fluorescerende celler i samfunnet.
Eksempler på gjær samfunn bestående av stammer som uttrykker røde og grønne fluorescerende proteiner demonstrere mulighetene til cryosectioning metode for å avsløre den romlige fordelingen av fluorescerende celler samt at av genuttrykk i gjær koloniene 2,3. Selv om vårt fokus har vært på Saccharomyces cerevisiae lokalsamfunn, kan samme metode potensielt brukes til å undersøke andre mikrobielle samfunn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prosedyren som presenteres her tilbyr en måte å inspisere den interne strukturen av gjær lokalsamfunn. Metanolen fikse trinnet gjør gjær kolonien stive 8 og bevarer integriteten av kolonien, men det fører også til krymping 8 som bør tas hensyn til i å tolke resultatene. Vi vanligvis ser rundt 30% svinn i høyden av gjær kolonier, sammenlignet med kolonier direkte innebygd i OCT uten å rette 9.
For å unngå svinn, er en alternativ tilnærming for c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Jonathan Cooper Lab ved Fred Hutchinson Cancer Research Center for tillatelse til å bruke deres kryostaten. Dette arbeidet ble støttet av NIH og WM Keck Foundation. BM er en Gordon og Betty Moore stipendiat of Life Science Research Foundation. Vi er takknemlige for Daniel Gottschling for å dele sin festing protokollen med oss.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. 유전학. 184 (3), 707-716 (2010).
