Cryosectioning Jäst gemenskapernas för att pröva Fluorescence mönster
Summary
Vi presenterar ett protokoll för frysning och cryosectioning jäst samhällen att observera inre mönster av fluorescerande celler. Metoden bygger på metanol fastställande av priser och oktober-inbäddning för att bevara den rumsliga fördelningen av celler utan att inaktivera fluorescerande proteiner i en gemenskap.
Abstract
Mikrober bor vanligtvis i samhällen. Den rumsliga organisation av celler i ett samhälle tros påverka överlevnad och funktion i samhället 1. Optiska sektioneringspunkter tekniker, inklusive konfokala och två-foton mikroskopi, har visat sig användbara för observation fysisk planering av bakterie-och archaeal gemenskapernas 2,3. En kombination av konfokal avbildning och fysisk sektionering av jästkolonier har avslöjat interna organisation celler 4. Dock har direkt optisk sektionering med konfokal eller två-foton mikroskopi bara kunnat nå några cellager djupt in jästkolonier. Denna begränsning är sannolikt på grund av en stark spridning av ljus från jästceller 4.
Här presenterar vi en metod som baseras på fastställande och cryosectioning få rumsliga fördelningen av fluorescerande celler i Saccharomyces cerevisiae samhällen. Vi använder metanol som fixativ medletatt bevara den rumsliga fördelningen av celler. Fasta samhällen infiltrerats med oktober förening, fryst och cryosectioned i en kryostat. Fluorescens avbildning av sektionerna visar den interna organisationen av fluorescerande celler i samhället.
Exempel på jäst samhällen bestående av stammar som uttrycker röda och gröna fluorescerande proteiner visar potentialerna hos cryosectioning metoden att avslöja den spatiala fördelningen av fluorescerande celler såväl som för genuttryck i jästkolonier 2,3. Även om vårt fokus har legat på Saccharomyces cerevisiae samhällen kan samma metod eventuellt användas för att undersöka andra mikrobiella samhällen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förfarandet som presenteras här erbjuder ett sätt att inspektera den inre strukturen av jäst samhällen. Metanol fixeringssteg gör jästkolonin stela 8 och bevarar integriteten av kolonin, men det orsakar också krympning 8 som bör beaktas vid tolkning av resultaten. Vi ser vanligtvis runt 30% krympning i höjd jästkolonier, jämfört med kolonier direkt inbäddade i oktober utan att fastställa 9.
För att undvika krympning, är ett alternativt tillv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Jonathan Cooper Lab vid Fred Hutchinson Cancer Research Center för tillstånd att använda deras kryostat. Detta arbete stöddes av NIH och WM Keck stiftelsen. BM är en Gordon och Betty Moore kamrat av Life Science Research Foundation. Vi är tacksamma för Daniel Gottschling för att dela hans fixering protokoll med oss.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. 유전학. 184 (3), 707-716 (2010).
