Enkel och effektiv teknik för framställning av Testicular cellsuspensioner
Summary
Ett nytt protokoll för mekanisk framställning av testikelcancer cellsuspensioner från gnagare material, undvika enzymer och rengöringsmedel, beskrivs. Metoden är mycket enkel, snabb, reproducerbar, och gör goda suspensioner kvalitets celler, som är lämpliga för flöde sortering och RNA-extraktion.
Abstract
Mammaliska testiklar är väldigt komplexa organ som innehåller över 30 olika celltyper, inklusive somatiska testikelceller och olika stadier av könsceller celler. Denna heterogenitet är en viktig nackdel om studiet av grunderna för däggdjur spermatogenes, som rena eller anrikade cellpopulationer i vissa skeden av spermier utveckling behövs för de flesta molekylära analyser 1.
Olika strategier såsom Staput 2,3, centrifugal elutriation 1, och flödescytometri (FC) har 4,5 använts för att erhålla anrikade eller renade testikulära cellpopulationer för att möjliggöra differentierade genuttrycksstudier.
Det krävs att cellerna är i suspension flesta anrikning / rening metoder. Helst ska cellsuspensionen vara representativa för den ursprungliga vävnaden, har en hög andel av livsdugliga celler och några multinucleates – som tenderar att bildas på grund av densyncytial karaktär av seminiferiepitel 6,7 – och saknar klumpar cell 1. Tidigare rapporter hade bevisat att testikel cellsuspensioner framställda genom en uteslutande mekanisk metod clumped lättare än trypsinerade ettor 1. Å andra sidan, enzymatiska behandlingar med RNAs och / eller disaggregerar enzymer såsom trypsin och kollagenas leder till specifika makromolekyler nedbrytning, vilket inte är önskvärt för vissa tillämpningar i efterföljande led. Den ideala processen ska vara så kort som möjligt och involvera minimal manipulation, för att uppnå ett gott bevarande av makromolekyler av intresse såsom mRNA. Nuvarande protokoll för framställning av cellsuspensioner från solida vävnader är oftast tidsödande, starkt operatörsberoende, och kan selektivt skada vissa celltyper 1,8.
Protokollet presenteras här kombinerar fördelarna med en mycket reproducerbar och extremt korta mekanisk uppdelning med enbsence av enzymatisk behandling, vilket leder till god suspensioner kvalitet cell som kan användas för flödescytometrisk analys och sortering 4, och dolda gen studier uttryck 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den optimerade här beskrivna metoden möjliggör framställning av cellsuspensioner från gnagare testikelvävnad på ett mycket snabbt och reproducerbart sätt som undviker enzym och detergentbehandling och bibehålla god cellernas integritet och proportioner typ. Den korta förfarandet (15 min span innehåller testiklarna dissektion, vävnad skärning och bearbetning), minimal hantering inblandade, och frånvaro av enzymatiska behandlingar är några av de viktigaste fördelarna. Alla dessa skulle stå för det goda …
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av CSIC (I + D projekt C022) och PEDECIBA. Författarna vill tacka Mariela Bollati och Valentina Porro från cellbiologi Unit (Institut Pasteur de Montevideo) för deras generösa samarbete rörande MoFlo cellsorteraren och Merial-Montevideo för försiktigt ge alla marsvin prover som används i detta projekt. Figur 1 var reproducerad med tillstånd av BioMed Central, fig 2 och 3, och tabell 1 med tillstånd av S. Karger AG, Basel, och figurerna 4 och 5 var reproduceras eller anpassats med tillstånd av John Wiley & Sons, Inc. (copyright ägs av Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L., Prescott, D. M. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
