Vi beskriver et kvalitativt assay til overvågning af bakteriel konkurrence medieret af<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Type VI sekretion system (T6SS). Assayet er baseret på overlevelsen / drab af Escherichia coli-målceller, der bærer en<em> LacZ</em>-Reporter. Denne teknik kan indstilles til at vurdere baktericid / bakteriostase aktivitet af T6SS-dygtige mikroorganismer.
Type VI sekretionssystemer (T6SSs) er molekylære nanomaskiner tillader gramnegative bakterier at transportere og tilføre proteiner i en lang række af målceller 1,2. Den T6SS består af 13 centrale komponenter og viser strukturelle ligheder med halen-rør af bakteriofager 3. Fagen anvender et rør og en punkteringsindretningen til at gennemtrænge cellekappe af målbakterier og injicere DNA. Det foreslås, at T6SS er en omvendt bakteriofag indretning skabe en specifik bane i bakteriecellen kuvert at drive effektorer og toksiner til overfladen. Fremgangsmåden kan træffes yderligere, og T6SS enhed kunne perforere andre celler, som bakterien er i kontakt, hvorved indsprøjtning af effektorer til disse mål. Halen røret og punkteringsindretningen dele af T6SS er lavet med HCP og VgrG proteiner, henholdsvis 4,5.
Alsidigheden af T6SS er blevet demonstreret gennem studies under anvendelse af forskellige bakterielle patogener. De Vibrio cholerae T6SS kan omforme cytoskelettet af eukaryote værtsceller ved injektion af en "udviklet" VgrG bærer en C-terminal actin tværbinding domæne 6,7. Et andet slående eksempel blev for nylig dokumenteret ved hjælp af Pseudomonas aeruginosa, som er i stand til at målrette og dræbe bakterier i en T6SS-afhængig måde, derfor fremme etableringen af bakterier i specifikke mikrobielle nicher og konkurrencepræget miljø 8,9,10.
I sidstnævnte tilfælde har tre T6SS-udskilte proteiner, nemlig Tse1, Tse2 og Tse3 blevet identificeret som toksiner injiceret i den pågældende bakterie (figur 1). Donorcellen er beskyttet mod den skadelige virkning af disse effektorer via en anti-toksin mekanisme, medieret af de Tsi1, Tsi2 og Tsi3 immunitet proteiner 8,9,10. Denne antimikrobielle aktivitet kan overvåges når T6SS-dygtige bakterier dyrkes sammen på sOlid overflader i konkurrence med andre bakteriearter eller med T6SS-inaktive bakterier af samme art 8,11,12,13.
De tilgængelige data understregede en numerisk tilgang til den bakterielle konkurrence-assay, herunder tidskrævende CFU optælling, der i høj grad afhængig antibiotiske beslutningstagere. I tilfælde af antibiotikaresistente stammer som P. aeruginosa, kan disse metoder være upassende. Desuden med identifikation af omkring 200 forskellige T6SS loci i mere end 100 bakterielle genomer 14, er en bekvem screening særdeles ønskelig. Vi udviklede et assay, der er let at anvende og kræver standard laboratorieudstyr og-reagenser. Fremgangsmåden giver en hurtig og kvalitativ teknik til at overvåge T6SS-bakteriedræbende / bakteriostase aktivitet ved hjælp af et reporter-stamme som en bytte (i dette tilfælde Escherichia coli DH5a), der tillader a-komplementering af lacZ-genet. Samlet set er denne fremgangsmåde grapHIC og muliggør hurtig kortlægning af T6SS-relaterede fænotyper på agarplader. Denne forsøgsprotokol kan tilpasses til andre stammer eller bakterielle arter under hensyntagen til særlige betingelser, såsom vækstmedium, temperatur eller tid for kontakt.
Den metode præsenteres i denne artikel giver mulighed for en visuel observation af T6SS-baktericid / bakteriostase aktivitet. Assayet udføres på overfladen af en agarplade. Det er tidligere blevet vist, at T6SS-afhængige drab-assay udført med blandet bakteriel flydende kultur ikke er effektivt, sandsynligvis på grund af manglen på stabil kontakt mellem de to bakterier 8. The T6SS menes at operere med en mekanisme, beslægtet med den, som bakteriofager at injicere DNA i målceller 17. I flydende kultur kan den rørlignende struktur af T6SS brækker lettere, kan inter-bakteriel kontakt gå tabt, og toksiner er ikke effektivt leveret.
Med hensyn til inkubationstider, er de 5 første timer af kontakt, vi beskriver mellem donor stamme og bytte tilstrækkeligt at bemærke bakteriel drab mellem P. aeruginosa og E. coli, som illustreret i figur 3 </strong>. Ikke desto mindre er det tilrådeligt at indstille inkubationstiden ved at udføre en kinetisk for at optimere de eksperimentelle betingelser.
Da denne metode er en farve baseret teknik kan produktionen resultater blive kompromitteret af pigmentering af donor-stammen. For eksempel i tilfælde af P. aeruginosa, visse stammer producerer høje niveauer af farvepigmenter som pyocyanin og pyoverdine, som kan forstyrre assayet udlæsning, at skelne fra bytte relativt vanskelig. Andre chromogene β-galactosidase-substrater, såsom magenta-gal eller det røde-gal, kan anvendes i stedet for X-gal (tabel 1).
The kompetitivt assay kan gøre brug af andre reportergener for udlæsningen. For eksempel har lignende assay ligeledes udført ved anvendelse af grønt fluorescerende protein-mærket byttedyr 12.
Vores analyse, mens ikke kvantitativ, giver en god indikationDen T6SS aktivitet, da den er baseret på overlevelsen eller aflivning af et reporter-bytte. Denne teknik har den fordel at være nem og bekvem at evaluere den baktericide / bakteriostase aktivitet af T6SSs fra alle bakteriearter. Hidtil har aktiviteten af T6SS vist imod gram-negative bakterier og nogen klar eksempel på T6SS-følsomme grampositive bakterier er blevet rapporteret endnu 12. Det er også klart, at uforenelighed i kulturen af de forskellige bakteriearter at prøve (f.eks væksttemperatur, iltnings, specifikke medier) betragtes.
Vores analyse kan også anvendes til at vurdere, hvilke af de T6SS komponenter er absolut nødvendigt, da selv spor af et udskilt toksin kan være tilstrækkelig til at dræbe byttet. Selv svage aktivitet af T6SS kunne så tydeligt påvises ved vores assay, sammenlignet med standard procedure test T6SS-afhængig sekretion ved hjælp af kultursupernatant og Western blotanalyse. Imidlertid er en passende kolonidannende enheder (CFU) optælling stadig behov for nøjagtig kvantificering af denne T6SS aktivitet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust tilskud WT091939MA. Alain Filloux er støttet af Royal Society.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
Scanner | Epson | V700 | |
Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |