Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Summary

Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una robusta<em> In vivo</em> Lectura de actividades similares a convulsiones. Esta técnica se puede utilizar con larvas de pez cebra transgénico que lleva genes relacionados con la epilepsia o las convulsiones provocadas por la administración de fármacos anticonvulsivos.

Abstract

La epilepsia afecta a casi 3 millones de personas en los Estados Unidos y hasta 50 millones de personas en todo el mundo. Se define como la aparición de convulsiones no provocadas espontáneos, la epilepsia puede ser adquirido como resultado de un daño cerebral o una mutación genética. Los esfuerzos para convulsiones modelo en animales han utilizado principalmente adquirido insultos (fármacos anticonvulsivos, estimulación o lesión cerebral) y las manipulaciones genéticas (knockdown antisentido, la recombinación homóloga o transgénesis) en roedores. El pez cebra son un sistema modelo vertebrado ^1-3 que podría proporcionar una valiosa alternativa a los roedores investigación basada en la epilepsia. El pez cebra se utilizan extensivamente en el estudio de la genética de vertebrados o de desarrollo, presentan un alto grado de similitud genética para los mamíferos y expresar homólogos de ~ 85% de las mutaciones conocidas humanos epilepsia de un solo gen. Debido a su pequeño tamaño (4-6 mm de largo), larvas de pez cebra puede ser mantenido en volúmenes de fluido tan bajo como 100 l durante el desarrollo temprano y arraYED en múltiples pocillos. Los reactivos se pueden añadir directamente a la solución en la que se desarrollan los embriones, la simplificación de la administración del fármaco y que permite una rápida selección in vivo de compuestos de ensayo ^4. Los oligonucleótidos sintéticos (morfolinos), mutagénesis, dedo de zinc nucleasa y enfoques transgénicos se pueden utilizar para generar rápidamente desmontables gen o mutación en el pez cebra ^5-7. Estas propiedades costear los estudios de pez cebra sin precedentes ventaja estadística sobre el análisis del poder roedores en el estudio de los trastornos neurológicos como la epilepsia. Debido a que el "estándar de oro" para la investigación epilepsia es monitorear y analizar las descargas eléctricas anormales que se originan en una estructura del cerebro central (por ejemplo, convulsiones), un método para grabar de manera eficiente la actividad cerebral en larvas de pez cebra se describe aquí. Este método es una adaptación de las técnicas convencionales de registro extracelular y permite una estabilidad a largo plazo de vigilancia de la actividad cerebral en larvas de pez cebra intacto. Sgrabaciones amplias se muestran para las convulsiones agudas inducidas por la aplicación de fármacos anticonvulsivos baño y convulsiones espontáneas grabadas en un pez modificado genéticamente.

Protocol

1. Huevo de Producción y Recolección El pez cebra cría sigue los procedimientos estándar descritos previamente 8. En pocas palabras, el pez cebra adultos se instalan en acuarios de cría con separadores en su lugar. Cuando las luces de la habitación se enciende a la mañana siguiente, los divisores son retirados de los tanques de cría y los peces se permiten aproximadamente 20 a 60 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados. Los huevos procedentes de tanques de cría se re…

Representative Results

Ejemplos de electrográfica convulsiva de descarga registrada en el cerebro anterior de un agar-incrustado larvas de pez cebra se muestra en la figura 1. De gran amplitud multi-pico de descarga ráfaga en estas muestras fue evocado por baño de aplicación de un fármaco anticonvulsivo, pilocarpina 40 mM (en A; 6 dpf) o 1 mM picrotoxina (en B; 8 dpf). En estas grabaciones, y inmovilizada agar-encajados pez cebra se controlan continuamente durante un máximo de 90 min. Fish siendo viable bajo estas condi…

Discussion

El método de registro extracelular presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de la actividad cerebral. Estas grabaciones son análogos a electroencefalográfica (EEG) de seguimiento comúnmente utilizado para evaluar la presencia de descarga eléctrica anormal (es decir, convulsiones) en modelos de roedores de epilepsia y ¹¹ pacientes ^12. Grabaciones extracelular se puede combinar con las manipulaciones farmacológicas, como se muestra aquí. Estos tipos de grabaciones …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Agarose low melting	Fisher-Scientific	BP1360-100	Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0.02%
α-bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg/ml
Capillary glass tubing	Warner Instruments	G120TF-3	Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier	Warner Instruments	PC-505B	We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions.
Filter/amplifier	Cygnus Technology	FLA-01	We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions.
Axon A/D board and Axoscope software	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2	Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions.
Egg water	Instant Ocean		3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water