स्ट्रक्चरल अध्ययन के लिए स्थिर का उत्पादन Disulfide transmembrane पेप्टाइड परिसर
Summary
Biophysical और जैव रासायनिक अध्ययन झिल्ली एम्बेडेड डोमेन प्रोटीन के बीच बातचीत के कई तकनीकी चुनौतियों, जो पहले की उपयुक्त अध्ययन सामग्री प्राप्त है का सामना करना पड़ता है. इस लेख के उत्पादन और शुद्ध डाइसल्फ़ाइड स्थिर transmembrane पेप्टाइड परिसरों कि समाधान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और अन्य विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों से संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Abstract
लिपिड झिल्ली प्रोटीन के एम्बेडेड अल्फा पेचदार डोमेन के बीच शारीरिक संबंधों को और झिल्ली प्रोटीन परिसरों की तह विधानसभा में और (टीएम) transmembrane संकेतन और सेल सतह प्रोटीन के स्तर के विनियमन के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. संरचनात्मक विशेष दृश्यों के सहयोग से ड्राइविंग सुविधाओं को समझना टीएम पेप्टाइड परिसरों के परिष्कृत biophysical और जैव रासायनिक विश्लेषण की आवश्यकता है. हालांकि, टीएम डोमेन के चरम hydrophobicity उन्हें बहुत मुश्किल बनाता मानक पेप्टाइड रसायन शास्त्र तकनीक का उपयोग में हेरफेर करने के लिए, और उपयुक्त अध्ययन सामग्री का उत्पादन अक्सर बेहद चुनौतीपूर्ण साबित होता है. शर्तों जिसके तहत पेप्टाइड्स स्थिर पेचदार रचना और फार्म परिसरों को अपनाने कर सकते हैं की पहचान अनायास कठिनाई का एक और स्तर कहते हैं. यहाँ हम होमोसेक्सुअल या सामग्री से असमलैंगिक dimeric टीएम पेप्टाइड परिसरों का उत्पादन कि ई. में व्यक्त कर रहे हैं के लिए एक प्रक्रिया उपस्थित ज़ीन, मैं इस तरह परमाणु चुंबकीय अनुनाद के लिए स्थिर आइसोटोप लेबल (एनएमआर) या अन्य अनुप्रयोगों के लिए अपेक्षाकृत सस्ते गैर प्राकृतिक एमिनो एसिड के समावेश की अनुमति. इस विधि में महत्वपूर्ण नवाचार है कि टीएम परिसरों का उत्पादन कर रहे हैं और covalently जुड़े (डाइसल्फ़ाइड Crosslinked) विधानसभाओं कि स्थिर, stoichiometric और सजातीय संरचनाओं फार्म जब डिटर्जेंट, लिपिड, या अन्य झिल्ली अनुकरण करनेवाला सामग्री में का पुनर्गठन कर सकते हैं के रूप में शुद्ध. हम भी वर्तमान अभिव्यक्ति और शोधन के लिए सावधानी से अनुकूलित प्रक्रियाओं है कि चाहे एकल टीएम डोमेन या Crosslinked परिसरों के निर्माण में समान रूप से लागू कर रहे हैं और नए टीएम दृश्यों के लिए इन तरीकों के अनुकूल ढालने के लिए सलाह प्रदान करते हैं.
Introduction
यह प्रोटोकॉल का विवरण एक प्रक्रिया है हम transmembrane डाइसल्फ़ाइड स्थिर संरचनात्मक समाधान एनएमआर का उपयोग कर अध्ययन के लिए परिसरों पेप्टाइड्स (टीएम) का उत्पादन करने के लिए विकसित किया है. प्रक्रिया मजबूत ΔtrpLE1413 संलयन प्रणाली (नीचे देखें) द्वारा afforded अभिव्यक्ति का लाभ लेता है और टीएम परिभाषित संरचना के पेप्टाइड परिसरों आधुनिक बहु – आयामी एनएमआर प्रयोगों के लिए परिष्कृत स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है. हम इन तकनीकों कार्यरत है कई एनएमआर संरचनाओं कि लिम्फोसाइट – सक्रिय immunoreceptors कई झिल्ली प्रोटीन से अपने टीएम डोमेन के बीच बातचीत के माध्यम से इकट्ठा कर रहे हैं (हाल ही में 1 समीक्षा) के बारे में महत्वपूर्ण नई जानकारी से पता चला निर्धारित. इन तकनीकों में कई अन्य झिल्ली प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सिस्टम समाधान एनएमआर अलावा बहाव विश्लेषणात्मक तरीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू कर रहे हैं. जबकि यहाँ दिए गए उदाहरण देशी सिस्टीन अवशेषों का इस्तेमालएक जटिल है कि स्वाभाविक रूप से डाइसल्फ़ाइड बंधुआ प्रोटीन mimics बनाने, डिजाइन इंजीनियर डीसल्फाइड बॉन्ड कि परिसरों आम तौर पर कमजोर, होमोसेक्सुअल और hetero-dimeric के टीएम परिसरों के रूप में इस तरह के गैर सहसंयोजक बातचीत के द्वारा एक साथ आयोजित कर रहे हैं को स्थिर बनाने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) परिवार 2-4 प्रोटीन या heterodimeric αβ Integrin 5,6 परिसरों.
लिपिड से प्राप्त उन लोगों के रूप में अत्यंत hydrophobic पेप्टाइड दृश्यों bilayer टीएम प्रोटीन के कुछ भागों में फैले जैव रासायनिक और biophysical अध्ययन के लिए बेहद मुश्किल विषय हैं. बहुत चुनौतीपूर्ण होने के मानक प्रोटीन और पेप्टाइड रसायन तकनीक का उपयोग में हेरफेर करने के लिए इसके अलावा, वे अक्सर काफी कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं और इसलिए कर रहे हैं recombinantly उत्पादन मुश्किल है. हम 7,8 और 9-11 दूसरों पड़ा महत्वपूर्ण फ्रेम carboxy टर्मिनल के रूप में इस तरह के बैक्टीरिया में मुश्किल पेप्टाइड दृश्यों व्यक्त सफलताΔtrpLE1413 अनुक्रम का एक संशोधित संस्करण ई. से व्युत्पन्न fusions कोलाई trp operon 12. T7 प्रमोटर के तहत उच्च स्तर पर ~ 13 केडीए trpLE इस अनुक्रम द्वारा इनकोडिंग पॉलीपेप्टाइड उत्पादन किया जा सकता है और पूरी तरह से समावेश शरीर जहां विषाक्तता और / या अस्थिरता से संबंधित समस्याओं circumvented स्थानीय. अनुक्रम के एक 9-हिस्टडीन 13 टैग और 14 की अनुमति दी trpLE पेप्टाइड धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध हो और पचा fusions विषैली गैस ब्रोमाइड (CNBr का उपयोग trpLE अनुक्रम से आंतरिक methionine और सिस्टीन अवशेषों के उन्मूलन अमीनो टर्मिनल के अलावा द्वारा संशोधन ) जारी करने के लिए वांछित पेप्टाइड अनुक्रम. हम सफलतापूर्वक इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है trpLE fusions झिल्ली प्रोटीन टुकड़ों कि टीएम डोमेन के रूप में कई के रूप में चार होते हैं का प्रतिनिधित्व के रूप में एक दर्जन से अधिक विभिन्न दृश्यों से अधिक व्यक्त (7,8 और अप्रकाशित परिणाम भी चर्चा अनुभाग देखें).
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण नवाचार परिस्थितियों में जो असंरचित और बहुत खराब घुलनशील trpLE टीएम fusions कुशलता से एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो के संदर्भ में डाइसल्फ़ाइड Crosslinked हो सकता है की पहचान है. उच्च उपज अभिव्यक्ति से निपटने, और पेप्टाइड उत्पादों की शुद्धि के कई पहलुओं को भी अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है, और यहाँ प्रस्तुत सिफारिशों गैर डाइसल्फ़ाइड Crosslinked (monomeric) टीएम पेप्टाइड उत्पादों के उत्पादन के लिए भी उतना ही प्रासंगिक हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
TrpLE टीएम fusions की अभिव्यक्ति. हमारे अनुभव में, trpLE टीएम fusions 37 डिग्री सेल्सियस पर खराब कर रहे हैं अमीर संस्कृति के माध्यम में व्यक्त की, और संस्कृति यहाँ वर्णित शर्तों पैदावार लेकर के साथ चार टीएम डोमेन से य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
और विक्टोरियन सरकार (MEC VESKI अभिनव फैलोशिप, ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (स्वतंत्र अनुसंधान संस्थान बुनियादी सुविधाओं का समर्थन योजना [IRIISS] WEHI अनुदान NHMRC परियोजना MEC और MJC के लिए अनुदान 1011352) के द्वारा इस कार्य के लिए अनुदान प्रदान किया जाता है; विक्टोरियन राज्य सरकार परिचालन बुनियादी सुविधाओं WEHI के लिए सहायता). MEC ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद की महारानी एलिजाबेथ द्वितीय फैलो है. EFXB नोर्मा Hilda शूस्टर छात्रवृत्ति कार्यक्रम मेलबोर्न विश्वविद्यालय में से समर्थन मानता है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
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