Produktion av disulfid-stabiliserade transmembran peptidkomplex för strukturstudier
Summary
Biofysiska och biokemiska studier av interaktioner mellan membran-inbäddade proteindomäner inför många tekniska utmaningar, varav den första är att få lämplig studiematerial. Denna artikel beskriver ett protokoll för framställning och rening av disulfid-stabiliserade komplexen transmembrana peptid som är lämpliga för strukturell analys genom lösning kärnmagnetisk resonans (NMR) och andra analytiska tillämpningar.
Abstract
Fysiska interaktioner mellan lipid-inbäddade alfa-spiralformade domäner av membranproteiner spelar en avgörande roll för veckning och sammansättning av komplex membranprotein och dynamiska processer, såsom transmembran (TM) signalering och reglering av cellytprotein nivåer. Förstå de strukturella drag som driver sammanslutning av enskilda sekvenser kräver sofistikerade biofysiska och biokemiska analyser av TM peptidkomplex. Emellertid gör den extrema hydrofobiciteten av TM-domäner dem mycket svåra att manipulera med användning av standardtekniker peptidkemi, och produktion av lämpligt studiematerial ofta visar oöverkomligt utmanande. Identifiera vilka villkor peptider kan anta stabila spiralformade konformationer och komplex bildas spontant lägger ytterligare en svårighetsgrad. Här presenterar vi ett förfarande för framställning av homo-eller hetero-dimera TM komplex peptid från material som uttrycks i E. colI, vilket möjliggör inkorporering av stabila isotopen etiketter för kärnmagnetisk resonans (NMR) eller icke-naturliga aminosyror för andra tillämpningar relativt billigt. Nyckeln innovationen i denna metod är att TM komplex produceras och renas som kovalent associerade (disulfid-tvärbundna) anordningar som kan bilda stabila, stökiometrisk och homogena strukturer vid rekonstituering i tvättmedel, lipid eller andra membran-mimetiska material. Vi presenterar också noggrant optimerade rutiner för uttryck och rening som är lika tillämpliga om att producera enkla TM domäner eller tvärbundna komplex och ge råd för att anpassa dessa metoder till nya TM-sekvenser.
Introduction
Detta protokoll detaljer ett förfarande som vi har utvecklat för att producera disulfid-stabiliserade komplex av transmembran (TM) peptider för strukturella studier med lösning NMR. Proceduren tar fördel av den robusta uttryck som ges av ΔtrpLE1413 fusion systemet (se nedan) och låter TM peptid komplex av definierad sammansättning som skall genereras med hjälp av sofistikerade stabil-isotopmärkning tekniker för moderna flerdimensionella NMR-experiment. Vi har använt dessa tekniker för att bestämma flera NMR strukturer som avslöjade viktig ny information om hur lymfocyt-aktiverande immunoreceptors monteras från flera subenheter membran protein genom interaktioner bland sina TM domäner (nyligen granskas 1). Dessa tekniker kan tillämpas på många andra system membranprotein samt ett brett utbud av nedströms analysmetoder förutom lösning NMR. Medan exemplet som ges här utnyttjar nativa cysteinresteratt skapa en komplex som efterliknar naturligt disulfidbunden proteinet, är konstruktionen lika väl lämpad för att skapa modifierade disulfidbindningar att stabilisera komplex som normalt hålls samman av svagare, icke-kovalenta interaktioner såsom homo-och hetero-dimera TM komplex av epidermal tillväxtfaktor (EGFR)-familjen proteiner 2-4 eller heterodimera αβ integrin komplex 5,6.
Extremt hydrofoba peptidsekvenser såsom de som härrör från lipiddubbelskiktet-överbryggande delar av TM-proteiner är ytterst svåra ämnen för biokemiska och biofysiska studier. Förutom att vara mycket utmanande att manipulera med standard protein och peptid tekniker kemi, är de ofta ganska toxisk för celler och är därför svåra att framställa rekombinant. Vi 7,8 och andra 9-11 har haft betydande framgång som uttrycker sådana svåra peptidsekvenser i bakterier som i ram karboxiterminalfusioner till en modifierad version av ΔtrpLE1413 sekvens härledd från E. E. coli trp-operonet 12. Den ~ 13 kDa trpLE polypeptid som kodas av denna sekvens kan produceras på höga nivåer under en T7-promotor och är helt lokaliserad till inklusionskroppar där problem med toxicitet och / eller instabilitet kringgås. Modifiering av sekvensen genom tillsats av en aminoterminal 9-histidinmärkning 13 och eliminering av interna metionin och cystein rester från trpLE sekvensen 14 tillåts trpLE-peptid-fusioner som skall renas genom metall-jon affinitetskromatografi och digererades med cyanogenbromid (CNBr ) för att frigöra den önskade peptidsekvensen. Vi har framgångsrikt använt detta system för att uttrycka mer än ett dussin olika sekvenser som trpLE fusioner representerar fragment membranprotein som innehåller så många som fyra TM-domäner (7,8 och opublicerade resultat, se även DISKUSSION avsnitt).
Denviktig innovation i detta protokoll är identifieringen av villkoren för ostrukturerade och mycket svårlösliga trpLE-TM fusioner kan vara effektivt disulfid-tvärbunden i samband med ett strömlinjeformat arbetsflöde. Flera aspekter av högavkastande uttryck, hantering och rening av peptid produkter har också noggrant optimerats och rekommendationerna som presenteras här är lika relevanta för produktion av icke-disulfid-tvärbundna (monomer) TM peptid-produkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uttryck av trpLE-TM fusioner. Enligt vår erfarenhet är trpLE-TM fusioner dåligt uttryckt i rikt odlingsmedium vid 37 ° C och odlingsbetingelser som beskrivs här har visat sig vara framgångsrika för många olika sekvenser innehållande 1-4 TM domäner med avkastningen varierar 50 till 150 mg / l av ren, intakt fusion. Fusioner kodning tre-eller fyra-TM GPCR fragment (humant CCR5 TM1-TM3 och TM4-TM7, respektive) eller en kärna katalytisk fragment av humant signalpeptid peptidas (fyra TM-domäner, se ref <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen för detta arbete ges av den nationella hälso-och Medicinska forskningsrådet i Australien (NHMRC projektbidrag 1.011.352 till MEC och MJC, oberoende forskningsinstitut Infrastruktur stödsystem [IRIISS] bidrag till WEHI) och den viktorianska regeringen (Veski Innovation Fellowship till MEC; Viktorianska delstatsregeringen operativa infrastruktur Stöd till WEHI). MEC är en drottning Elizabeth II kamrat av Australian Research Council. EFXB erkänner stöd från Norma Hilda Schuster Scholarship Program vid University of Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer–monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. 생화학. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer’s amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
