In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Summary

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen. Een<em> In vivo</em> Twee-foton beeldvorming methode wordt hier beschreven die het mogelijk maakt het volgen van dergelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen door middel van genetisch gecodeerd verslaggevers.

Abstract

De hersenen het vermogen te veranderen in reactie op ervaring is essentieel voor gezonde hersenfunctie, en afwijkingen in dit proces bijdragen van verschillende hersenaandoeningen ^1,2. Om een ​​beter begrip van de mechanismen waarmee hersencircuits reageren bieden een dier vereist het vermogen om de ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in een bepaalde set van neuronen monitoren gedurende een langere periode, in het levende dier. De ervaring en bijbehorende neurale activiteit bekend genexpressie veranderingen in neuronen ^1,2 veroorzaken ^de meeste methoden om dergelijke veranderingen te detecteren niet mogelijk herhaalde waarneming van dezelfde neuronen over meerdere dagen of niet voldoende resolutie om acht individuele neuronen ^{3 , 4.} We beschrijven een methode die in vivo twee-foton microscopie combineert met een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter ervaring-afhankelijke genexpressie in de individuele corticale neuronen volgen de loop van dag tot dag bieden.

Een van de gevestigde ervaring-afhankelijke genen is Activity-gereguleerde cytoskelet geassocieerde eiwit (Arc) ^5,6. De transcriptie van Arc is zeer snel en zeer geïnduceerd door verscherpte neuronale activiteit ³ en het eiwitproduct reguleert de endocytose van glutamaatreceptoren en langdurige synaptische plasticiteit ^7. De expressie van Arc is op grote schaal gebruikt als een moleculaire marker om neuronale circuits betrokken bij specifieke gedrag ³ kaart. In de meeste van deze studies werd Arc expressie gedetecteerd door in situ hybridisatie of immunohistochemie in vaste hersencoupes. Hoewel deze methoden blijkt dat de expressie van Arc werd gelokaliseerd op een subset van neuronen na exciterend gedrag bieden, hoe de patronen van cellulaire Arc expressie kan veranderen met meerdere episodes van herhaalde onderscheidend ervaringen over dagen niet onderzocht.

ntent "> In vivo twee-foton microscopie een krachtige manier om ervaring op-afhankelijke cellulaire veranderingen in het levende brein ^8,9 onderzoeken biedt. Om het onderzoek van de Arc expressie in levende neuronen mogelijk te maken door twee-foton microscopie, we eerder genereerde een knock- in muizenlijn waarin een GFP reporter wordt geplaatst onder de controle van de endogene promoter Arc ^10. Dit protocol beschrijft chirurgische preparaten en imaging procedures voor het bijhouden bieden afhankelijke Arc-GFP expressie patronen in neuronale ensembles in het levende dier. In deze werkwijze , chronische craniale ramen werden eerst geïmplanteerd in Arc-GFP muizen over de corticale gebieden plaats. Deze dieren werden vervolgens herhaaldelijk afgebeeld door twee-foton microscopie na gewenste gedragsparadigma's in de loop van enkele dagen. Deze methode kan algemeen voor dieren met andere fluorescerende verslaggevers van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen ^4.

Protocol

De experimentele procedures die hieronder worden beschreven werden goedgekeurd door het National Institute of Mental Health Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. Pre-operatieve voorbereiding Reinig alle gereedschap in een hete kraal sterilisator voor aseptische chirurgie, het reinigen van de operatie site met 70% ethanol, en zette schoon drop doeken. Draag sterie…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een methode om ervaring afhankelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen in levende dieren volgen. Een chronische craniale venster is voor het eerst gemaakt over een corticaal gebied van interesse in een muis die een fluorescerende reporter van genexpressie. Twee-foton microscopie kan vervolgens worden gecombineerd met verschillende gedrag paradigma gedragsmatig geïnduceerde moleculaire veranderingen in individuele neuronen waarnemen en volgen deze wijzigingen in de…

Discussion

De in vivo imaging hier beschreven werkwijze kan herhaald onderzoek Arc genexpressie verandert op dezelfde sets van neuronen gedurende meerdere dagen in het levende dier. Het is een efficiënte en veelzijdige methode om informatie over neurale plasticiteit gerelateerde moleculaire dynamica in individuele neuronen verkrijgen in reactie op verschillende gedrag vertonen. Standaard histochemische methoden zoals in situ hybridisatie en immunohistochemie kan eencellige resolution ^{3 bereiken,} maar …

Materials

Name of the Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
FV1000 multi-photon laser scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissection microscope	Omano	555V107	Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice	Harvard Apparatus	726335	Surgery
20X or 25X water immersion objective	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscope stage with head-fixation frame	Custom made	N/A	Imaging
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Surgery
Dental drill burr	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging