Identificación de los<em> La Bella Durmiente</em> Transposón inserciones en tumores sólidos utilizando vinculador mediada por PCR
Summary
Un método de identificación de conductores desconocidos de la carcinogénesis utilizando un enfoque imparcial se describe. El método utiliza el<em> La Bella Durmiente</em> Transposón como un mutágeno aleatorio dirigido a tejidos específicos. Mapeo genómico de inserciones de transposones que impulsan la formación de tumores identifica nuevos oncogenes y genes supresores tumorales
Abstract
Los análisis genómicos, proteómicos, transcriptómica y epigenómico de tumores humanos indican que hay miles de anomalías dentro de cada genoma del cáncer en comparación con el tejido normal correspondiente. Sobre la base de estos análisis es evidente que hay muchos conductores no descubiertos genéticas del cáncer 1. Lamentablemente, estos conductores están ocultos dentro de un número mucho mayor de anomalías de pasajeros en el genoma que no contribuyen directamente a la formación de tumores. Otro aspecto del genoma del cáncer es que hay una considerable heterogeneidad genética dentro de similares tipos de tumores. Cada tumor pueden albergar diferentes mutaciones que proporcionan una ventaja selectiva para la formación de tumor 2. Realización de una pantalla hacia delante imparcial genética en ratones proporciona las herramientas para generar tumores y analizar su composición genética, mientras que la reducción del fondo de mutaciones de pasajeros. La Bella Durmiente (SB) transposón sistema es uno de esos métodos 3. El sistema utiliza SB móvil vectores (transposones) que se pueden insertar en el genoma de la enzima transposasa. Las mutaciones se limitan a un tipo específico de célula mediante el uso de un alelo condicional transposasa que se activa por la recombinasa Cre. Muchas líneas de ratón que expresan existen recombinasa Cre en tejidos específicos. Al cruzar una de estas líneas con el alelo transposasa condicional (por ejemplo, Lox-stop-Lox-SB11), el sistema SB se activa sólo en las células que expresan la recombinasa Cre. La recombinasa Cre extirpará una casete de tope que bloquea la expresión del alelo de la transposasa, activando de este modo mutagénesis de transposones en el tipo de célula designada. Una pantalla SB es iniciada por la cría de tres cepas de ratones transgénicos para que los ratones experimentales llevar un alelo condicional transposasa, un concatémero de transposones, y un alelo específico de tejido de recombinasa Cre. Estos ratones se dejaron envejecer hasta que se forman los tumores y se convierten moribundo. Los ratones son luegoADN genómico practicó la necropsia y se aísla de los tumores. A continuación, el ADN genómico se somete a enlazador mediada-PCR (LM-PCR) que resulta en la amplificación de loci genómicos que contienen un transposón SB. LM-PCR realizada en un solo tumor se traducirá en cientos de amplicones diferentes que representan a los cientos de loci genómicos que contienen inserciones de transposones en un solo tumor 4. Las inserciones de transposones en todos los tumores son analizados y los sitios comunes de inserción (IIC) se identifican usando un método estadístico adecuado 5. Los genes dentro de la CEI es muy probable que sea oncogenes o genes supresores de tumores, y se consideran los genes candidatos cáncer. Las ventajas de utilizar el sistema de SB para identificar genes candidatos cáncer son: 1) el transposón puede ser fácilmente localizado en el genoma, ya que su secuencia es conocida, 2) transposición se puede dirigir a casi cualquier tipo de célula y 3) el transposón es capaz de introduciendo al mismo tiempo de ganancia y pérdida de función de las mutaciones 6. El following protocolo describe cómo diseñar y ejecutar una pantalla hacia delante genético utilizando el sistema de transposón SB para identificar genes candidatos cáncer (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Una pantalla hacia delante genética utilizando la Bella Durmiente transposón sistema proporciona un método para la identificación de las mutaciones que causan cáncer. Mediante la selección del promotor apropiado para controlar la recombinasa Cre en adición a cualquier mutaciones que predisponen, la pantalla SB identificará conocidos y nuevos genes candidatos cáncer.
El éxito de una pantalla SB depende en gran medida de los ratones seleccionados para la creación d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Moriarity Branden, Largaespada David, y Keng Vicente de la Universidad de Minnesota, y Dupuy Adán en la Universidad de Iowa por su ayuda en el desarrollo del protocolo descrito anteriormente.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
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