Identifiering av<em> Törnrosa</em> Transposoninsättningar i solida tumörer med Linker-medierad PCR
Summary
En metod för att identifiera okända förare av karcinogenes användning av en opartisk tillvägagångssätt beskrivs. Metoden använder<em> Törnrosa</em> Transposon som en slumpmässig mutagen riktad till specifika vävnader. Genomisk kartläggning av transposoninsättningar som driver tumörbildning identifierar nya onkogener och tumörsuppressorgener
Abstract
Genomiska, proteomik, transcriptomic och epigenomic analyser av humana tumörer tyder på att det finns tusentals anomalier inom varje cancer genomet jämfört med matchade normal vävnad. Baserat på dessa analyser är det uppenbart att det finns många oupptäckta genetiska förare av cancer 1. Tyvärr dessa drivrutiner är dolda i ett mycket större antal passagerare avvikelser i genomet som inte direkt bidrar till tumörbildning. En annan aspekt av cancer genomet är att det finns en stor genetisk heterogenitet inom liknande tumörtyper. Varje tumör kan hysa olika mutationer som ger en selektiv fördel för tumörbildning 2. Utföra en opartisk framåt genetisk skärm i möss ger förutsättningar för att generera tumörer och analysera deras genetiska sammansättning, samtidigt som bakgrunden för passagerare mutationer. The Sleeping Beauty (SB) transposon system är en sådan metod 3. SB-systemet utnyttjar mobil vavskärmare (transposoner) som kan införas i hela genomet genom den transposas enzymet. Mutationer är begränsade till en specifik celltyp genom användning av en villkorlig transposas allel som aktiveras av Cre-rekombinas. Många muslinjer existerar som uttrycker Cre-rekombinas i specifika vävnader. Genom att korsa en av dessa linjer till den villkorade transposaset allelen (t.ex. Lox-stop-Lox-SB11) är SB-systemet aktiveras endast i celler som uttrycker Cre rekombinas. Cre rekombinas kommer punktskatt stopp kassett som blockerar uttrycket av transposas allelen, därigenom aktivera transposon mutagenes inom den angivna celltypen. En SB skärm initieras genom avel tre stammar av transgena möss så att de experimentella mössen bär en villkorlig transposas allel, en konkatamer av transposoner och en vävnadsspecifik Cre-rekombinas allel. Dessa möss får ålder tills tumörer form och de blir döende. Mössen är sedanobduceras och genomiskt DNA isoleras från tumörerna. Därefter är det genomiska DNA utsattes för linker-medierad-PCR (LM-PCR) som resulterar i amplifiering av genomiska loci innehållande en SB transposon. LM-PCR utförs på en enda tumör kommer att resultera i hundratals olika amplikoner representerar hundratals genomiska loci innehåller transposoninsättningar i en enda tumör 4. De transposoninsättningar i alla tumörer analyseras och gemensamma insertionsställen (CISS) identifieras med hjälp av en lämplig statistisk metod 5. Gener inom OSS är mycket sannolikt att onkogener eller tumörsuppressorgener, och anses kandidat cancer gener. Fördelarna med att använda SB-systemet för att identifiera gener kandidat cancer är: 1) transposonen kan lätt lokaliseras i genomet, eftersom dess sekvens är känd, 2) kan riktas till nästan alla celltyper och 3) transposonen kan införlivandet införa både vinst-och förlust-av-funktion mutationer 6. Den following-protokollet beskriver hur man utforma och genomföra en framåt genetisk skärmen med hjälp av SB transposonen för att identifiera gener kandidat cancer (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
En framåt genetisk skärmen med hjälp av Törnrosa transposonen systemet ger en metod för att identifiera mutationer som orsakar cancer. Genom att välja lämplig promotor för att styra Cre rekombinas utöver eventuella predisponerande mutationer kommer SB-skärmen identifiera kända och nya kandidatgener cancer.
Framgången för en SB skärmen är till stor del beroende på de möss som valts för att skapa skärmen. För transposonen rekommenderar vi att du använder …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Branden Moriarity, David Largaespada, och Vincent Keng vid University of Minnesota, och Adam Dupuy vid universitetet i Iowa för deras hjälp med att utveckla protokollet beskrivet ovan.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
