단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.
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이 논문에서
요약
초록
프로테오믹스 연구는 전례없는 정밀도 진핵 세포 프로테옴의 인상적인 복잡성을 밝혔다. 지금 세포에있는 단백질은 주로 고립 된 개체로하지 존재하지만, 대부분의 경우 모든 생명 기능을위한 셀의 조립 라인을 형성, 인간 10 명 이상, 많은 다른 단백질과 관련있는 생물학적 활성을 발휘하는 일반적으로 인정 개념이다. 1 이 multiprotein의 어셈블리의 기능과 구조의 2 지식은 자세한 분석을 위해 우수한 품질과 충분한 양에서의 공급이 필요합니다. 세포에서 많은 단백질 단지의 소수는 진핵 세포에서 특히 네이티브 소스에서 해당 추출을 금지하고, 재조합 생산을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)는 진핵 생물의 단백질을 생산하는 데 특히 유용한 것으로 입증되었습니다,의 활동은 종종 번역 후 처리에 의존하는 다른 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 종종 할 수있는지원하지 3. BEVS 관심의 유전자가 차례로 선택의 단백질을 생산하는 곤충 세포 배양을 감염 삽입 된 재조합 배큘로 바이러스를 사용합니다. MultiBac 특히 많은 소단위를 포함하는 진핵 세포 단백질 단지의 생산을위한 맞춤형 된 BEVS이다. 4 효율적인 단백질 생산과 단지를위한 중요한 전제 조건 이상적으로 구현 될 수있는 식 실험에 관련된 모든 단계에 대한 강력한 프로토콜입니다 표준 작업 절차 (SOP)와 비교 쉽게 전문가가 아닌 사용자도 따랐다. 유럽 분자 생물학 연구소 (EMBL)에서 MultiBac 플랫폼은 단백질의 소규모 분석 외래 단백질 생산 특성에 최적화 된 설계 baculoviral 게놈에 유전자의 삽입부터 시작 multiprotein의 복잡한 발현 실험에 관련된 모든 단계에 대한 SOP를 사용 생산 시편. 5-8 플랫폼EMBL 그르노블에서 오픈 액세스 모드로 설치되어 학계 및 단백질의 복잡한 연구 프로젝트를 가속화하는 업계의 많은 과학자를 지원하고 있습니다.
서론
생물학적 활성은 단백질과 세포 기능을 촉진하기 위해 콘서트에서 역할을 다른 생체 분자의 어셈블리에 의해 제어됩니다. 주목할만한 예는 메신저 RNA에 DNA에 들어있는 유전 정보를 표기 기계 있습니다. 인간, 100 개 이상의 단백질이다 RNA 중합 효소 II와 같은 TFIID, TFIIH 등과 같은 일반적인 전사 인자. 9 다른 예제를 포함하여 10 더 소단위 대형 multiprotein의 단지를 형성 유전자를 속기 정의와 규제 과정에서 함께 온 리보솜, 단백질 합성, 또는 진핵 생물의 핵 봉투를 통해 생체 분자를 왕복을 담당하는 핵 기공 복합체를 촉매 많은 단백질과 RNA 분자로 구성. 셀에 기본적으로 모두 다 성분계 시스템의 상세한 건축 및 생화학 해부 그들의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 원핵 세포와 eukar의 구조 규명yotic 리보솜은, 예를 들어, 이러한 고분자 기계 셀에 자신의 지정된 기능을 수행하는 방법에 전례없는 통찰력을 항복 특징 이벤트를 창설. 10,11
리보솜은 최대 세포 질량의 30 %가 리보솜으로 구성되어 있다는 사실로 인해 배양 세포에서 내인성 물질을 정화하여 자세한 연구를위한 충분한 질과 양에서 얻을 수 있습니다. RNA 중합 효소 II는 다른 중요한 단지의 압도적 ....
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프로토콜
1. Multigene 사 식 구문 생성을위한 텐덤 Recombineering (TR)
- 공동 식 전략 계획. 기증자와 수락 자에 관심 유전자를 삽입하기위한 설계 방법. 귀하의 복잡한 잠재적 인 생리 서브 모듈은 특정 수락 자 및 기증자에 함께 그룹화해야합니다. 개인 기증자와 수락 플라스미드에서 발현 카세트를 결합 BstXI 쌍 7,8는 실리코에 관련된 모든 구문을 생성하고 실험적인 작업을 진행하기 전에 철저하게 전략을 검증 - 원점 복귀 효소 (HE)으로 구성된 곱셈 모듈을 사용합니다.. 예를 들어, 그 유전자는 HE 또는 다른 제한 사이트 및 정확한 열린 독서 프레임 (ORF를)의 존재를 확인해야한다 포함하지 않는 것으로 확인해야합니다. 단백질 생산 수준뿐만 아니라 EXI의 제거를 향상시키기 위해 곤충 세포 코돈과 mRNA의 이차 구조에 최적화 된 합성 유전자를 주문하는 것을 고려해야HE 관심의 유전자에서 사이트 찌르기. 유연한 또는 노출 된 N-또는 선택의 단백질의 C-말단에 대한 문헌 데이터를 기반으로 정화 태그를 배치하는 것이 좋습니다. 개별 단백질의 상대적 양이 복잡한에 의한 화학 양론 문제 제어해야하는 경우 복잡한 여러 가지 단백질 소단위 생산을 목표로 polyprotein 전략을 적용하는 것이....
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결과
MultiBac 시스템에 의해 달성 이종 단백질의 강력한 공동 발현은 그림 1D (서스펜션 세포 배양 감염 후 48 시간 촬영 프로브)에 표시됩니다. 과다 발현 단백질 밴드는 전체 세포 추출물 (SNP) 및 삭제 해물 (SN)에 명확하게 식별 할 수 있습니다. 생산 된 단백질 재료의 품질과 수량은 종종 그림 1E에서와 같이 같은 유사 분열 체크 포인트 복잡한 MCC 등의 단백질 복합체의 구조 결정을 가능하게하기에 충분합니다. 17
그림 2는 로봇을 이용한 탠덤 recombineering (TR)에 의해 유전자의 조립 실험의 작업 흐름을 표시합니다. 강력한 DNA 어셈블리 프로토콜은 Multigene 사 식 구조의 병렬 조립 로봇 루틴에 스크립트했다. 개별 로봇 단계는 스냅 샷 (- IV 그림 2C, I)로 표시됩니다. 조립하는 DNA의 .......
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토론
그림 2와 3의 비디오 스냅 샷 Multigene 사 표현의 cDNA를에서 로봇을 이용한 세대에서 전체 프로세스를 설명하는 단백질 생산을위한 곤충 세포 배양 감염으로 모든 방법을 구성합니다. 새로운 시약 (플라스미드 및 바이러스) 및 강력한 프로토콜을 표준 운영 절차에 의존하는 파이프 라인을 사용하기 위해 개발되었습니다. 전체 파이프 라인은 그르노블에서 EMBL에서 플랫폼 기술로 구현되었습니다. MultiBac 플랫폼은 multiprotein의 연구에 종사하는 학계 및 업계의 많은 과학자들에 의해 읽혔습니다. 교육 접근은 유럽위원회 (P-CUBE, BioSTRUCT-X)에 의해 자금 전용 액세스 프로그램에 의해 지원됩니다.
MultiBac 시스템을 사용하여 단백질의 복잡한 표현을 수행하는 SOP를 여부는 전문가가 아닌 사용자도 쉽게 의무가이 기술을 렌더링하고있다. 로봇을 이용한 작업 partic에 multiprotein의 복잡한 생산을 가속화ul.......
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공개 사항
IB는 여기에 설명 된 기술의 일부를 자세히 설명 특허 및 특허 출원에 발명가이다.
감사의 글
우리는 크리스토프 Bieniossek, 사이먼 Trowitzsch, 다니엘 피츠 제럴드, 유이치로 타카, 크리스티안 Schaffitzel, 이본 Hunziker, 티모시 리치몬드와 도움과 조언 버거 실험실의 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. MultiBac 플랫폼과 개발했습니다 아낌없이 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) 직원은 국립 공들인 (ANR)와 센터 국립 공들인 Scientifique (CNRS)와 유럽위원회 (EC) 등의 자금 지원 기관에서 지원하는 프레임 워크 프로그램 (FP) 6과 7. 다국적 액세스에 대한 지원은 EC FP7 프로젝트 P-CUBE (에 의해 제공됩니다 www.p-cube.eu )와 BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). 과학의 프랑스 교육부는 특히 투자 회사 디 Avenir에서 프로젝트 FRISBI 통해 EMBL에서 MultiBac 플랫폼을 지원하기 위해 인정 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| 테트라사이클린 | Euromedex | UT2965-B(25g) | 1,000X에서 10mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420(25g) | 1,000X에서 50mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632(5g) | 1,000X에서 10mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B(5g) | 1,000X 1M에서 |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP 형질주입 시약 | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6웰 플레이트 Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2ml 피펫 Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5ml 피펫 Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10ml 피펫 Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25ml 피펫 Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50ml 피펫 Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50ml 튜브 Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15ml 튜브 Falcon | Dominique Dutscher | ||
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml 쉐이커 플라스크 Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml 쉐이커 플라스크 Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml 쉐이커 플라스크 Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L 쉐이커 플라스크 Pyrex | Dominique Dutscher | ||
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| 액체 질소 탱크 듀어 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| 생물 안전 캐비닛 더 빠른 | Sodipro | FASV20000606 | |
| 광학 현미경 | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 곤충 세포 | |||
| Hi5 곤충 세포 | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO 실행 Evoware 플러스 | TECAN | ||
| 10 μ l 전도성 팁 (검정색), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μ l 전도성 팁 (검정색) | TECAN | 10 612 510 | |
| 시약용 일회용 트로프, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR 플레이트 96, 스커트 | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 웰 V 바닥, 비멸균 | BD 팔콘 | 353263 | |
| 96 딥웰 플레이트 색상 자연, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS 마이크로플레이트, 96 웰 플랫 바닥 | Greiner | 655101 | |
| 96 딥웰 플레이트 | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24웰 블록 RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI 제한 효소 | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | 수제 | 7.5% 글리세롤, 0.031% 브로모페놀 블루, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| 낮은 DNA 질량 사다리 e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% 아가로스 GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin-robot-96 플라스미드 키트 | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR 클린업 키트, Nucleospin Robot-96 추출물 | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq 그린 마스터 믹스 | Promega | M7113 | |
| T4 DNA 중합효소, LIC 인증 | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 | mM | ||
| 우레아 2 M | 수제 | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | 수제 | ||
| LB 육수 (밀러) 500 g | 아테나 ES | 103 |
참고문헌
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay,....
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