Met behulp van hoge resolutie Computed Tomography om de driedimensionale structuur en functie van Plant vaatstelsel Visualiseer
Summary
Hoge resolutie x-ray tomografie (HRCT) is een niet-destructieve diagnostische beeldvormingstechniek die kan worden gebruikt om de structuur en functie van planten vasculatuur in 3D onderzoeken. We laten zien hoe HRCT vergemakkelijkt verkenning van xyleem netwerken over een breed scala van planten weefsels en soorten.
Abstract
Hoge resolutie x-ray tomografie (HRCT) is een niet-destructieve diagnostische beeldtechniek met sub-micron resolutie capaciteit die nu wordt gebruikt om de structuur en functie van planten xyleem netwerk evalueren in drie dimensies (3D) (bv. Brodersen et al. . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT beeldvorming is gebaseerd op dezelfde principes als medische CT systemen, maar een hoge intensiteit synchrotron x-ray source resulteert in hogere ruimtelijke resolutie en verlaagde beeldacquisitie tijd. Hier tonen we in detail hoe synchrotron gebaseerde HRCT (uitgevoerd bij de Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combinatie met Avizo software (VSG Inc, Burlington, MA, USA) wordt gebruikt om planten xyleem verkennen weggesneden weefsel en levende planten. Deze nieuwe imaging tool stelt gebruikers in staat verder te gaan dan de traditionele statische, 2D licht of electronenmicroscoop en studie monsters met behulp van virtuele seriële secties in elk vlak. Een oneindig aantal segmenten in elke oriëntatie ceen worden gemaakt op hetzelfde monster, een functie die fysiek onmogelijk is met traditionele microscopie methoden.
Resultaten tonen aan dat HRCT kan worden toegepast op zowel kruidachtige en houtachtige plantensoorten, en verschillende plantenorganen (bijvoorbeeld bladeren, bladstelen, stengels, stammen, wortels). Gepresenteerde cijfers hier ertoe bijdragen dat zowel een reeks representatieve planten vasculaire anatomie en het type van detail uit HRCT datasets, zoals scans voor kust redwood (Sequoia sempervirens), walnoot (Juglans spp.), Eik (Quercus spp.), En esdoorn ( Acer spp.) plantgoed aan zonnebloemen (Helianthus annuus), wijnstokken (Vitis spp.), en varens (Pteridium aquilinum en Woodwardia fimbriata). Uitgesneden en gedroogde monsters van houtige soorten zijn het gemakkelijkst te scannen en levert doorgaans de beste foto's. Echter, recente verbeteringen (dwz snellere scans en monster stabilisatie) maakte het Possbaar om deze visualisatie techniek te gebruiken op groen weefsels (bijv. bladstelen) en in levende planten. Bij gelegenheid enige krimp van gehydrateerde groene plant weefsels zal veroorzaken afbeeldingen om onscherpte en methoden om te voorkomen dat deze problemen worden beschreven. Deze recente ontwikkelingen met HRCT bieden veelbelovende nieuwe inzichten in fabriek vasculaire functie.
Introduction
Water wordt vervoerd van plantenwortels op de bladeren in een vasculair weefsel genaamd xyleem – een netwerk van onderling verbonden leidingen, vezels, en wonen, metabolisch actieve cellen. Transportfunctie van plantaardige xyleem moeten worden gehandhaafd om voedingsstoffen en water te leveren aan de bladeren voor fotosynthese, groei, en uiteindelijk overleven. Vervoer over water in xyleem leidingen kan worden verstoord wanneer de xyleem-netwerk in het gedrang komt door pathogene organismen. In reactie op dergelijke infecties installaties vaak gels, gommen en thyllen als middel om pathogeen spread isolaat (bv. McElrone et al. 2008; 2010). Droogte stress kan het vervoer over water ook beperken in xyleem. Zoals planten verliezen water tijdens langdurige droogte, spanning bouwt in het xyleem sap. Water onder spanning is metastabiel (dat wil zeggen op een bepaalde drempel van de spanning groot genoeg wordt om water kolommen in xyleem leidingen caviteren). Na cavitatie optreedt, kan een gasbel (embolie) vormen en vul de condvisitors, het effectief blokkeren van beweging van het water (Tyree en Sperry 1989), een fenomeen dat analoog aan decompressieziekte (dwz "de bochten") in diepzee duikers.
Ondanks het belang van xyleem vervoer over water voor een optimale planten functie, zoals aangetoond door een grote hoeveelheid historische en hedendaagse literatuur over dit onderwerp (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al., 2005), zijn er nog aspecten van xyleem netwerken die blijven ongrijpbaar . Verschillende onderzoeksgroepen hebben onlangs begonnen gebruik te maken van hoge resolutie X-stralen computertomografie micro-tomografie (HRCT) om fijnere details van hout anatomie en vasculair weefsel (bijv. Mayo et al. evalueren; 2010, 2008; Mannes et al. 2010;. Brodersen et al. 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda en Miyake, 2009; Steppe et al. 2004).. HRCT een destructieve techniek om functies in het inwendige van vaste objecten visualiseren en digitale informatie op de 3-D structuur te verkrijgen. HRCTverschilt van conventionele medische-CAT scanning in zijn vermogen om gegevens zo klein als een micron groot lossen, zelfs voor hoge dichtheid voorwerpen. Recente ontwikkelingen in de synchrotron HRCT technologie is verbeterd beeldresolutie en signaal-ruisverhouding voldoende, zodat planten schipverkeer en intervessel verbindingen kunnen worden gevisualiseerd, toegewezen 3D-coördinaten, en geëxporteerd voor hydraulische simulaties. Brodersen et al.. (2011) onlangs naar voren van deze techniek door de combinatie van 3D-reconstructies gegenereerd door synchrotron HRCT met een Fortran model dat automatisch de gegevens van het xyleem-netwerk haalt bij veel hogere resolutie dan ooit mogelijk was met traditionele anatomische methoden (dwz seriële snijden met een microtoom en het vastleggen van beelden met licht microscopie, bijvoorbeeld Zimmermann 1971). Dit werk is ook gebruikt om hydraulische modellen optimaliseren van het xyleem systeem en geïdentificeerd unieke kenmerken van transport (bijv. tegenstroom in sommige vessel tijdens periodes van piek transpiratie) (Lee et al.., in review).
Synchrotron HRCT kan nu gebruikt worden om xyleem functionaliteit gevoeligheid voor cavitatie en planten vermogen geëmboliseerd leidingen repareren visualiseren. Niet herstellen stroming in geëmboliseerd leidingen vermindert hydraulisch vermogen, grenzen fotosynthese, en resulteert in planten dood in extreme gevallen (McDowell et al.. 2008). Planten kunnen omgaan met embolieën door het omleiden van water rond blokkades via putten aansluiten van aangrenzende functionele leidingen, en door de groeiende nieuwe xyleem om verloren hydraulische capaciteit te vervangen. Sommige planten hebben de mogelijkheid om pauzes in het water kolommen te herstellen, maar de details van dit proces in xyleem onder spanning zijn bleef onduidelijk voor decennia. Brodersen et al.. (2010) onlangs gevisualiseerd en gekwantificeerd het vullen in levende wijnstokken met HRCT. Succesvolle schip bijvullen was afhankelijk van het water instroom van levende cellen rondom de XYLem leidingen, waar individuele waterdruppels uitgebreid na verloop van tijd, vol schepen, en gedwongen de ontbinding van ingesloten gas. De capaciteit van de verschillende planten om gecompromitteerd houtvaten en de mechanismen die deze reparaties te herstellen worden momenteel onderzocht.
Beschrijving van de ALS-faciliteit Beamline 8.3.2
Ons werk tot nu toe is verricht op de harde X-stralen micro-tomografie Beamline 8.3.2 op de Advanced Light Source in Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plant monsters worden in een met lood beklede hok op 20 meter van de röntgenbron, gegenereerd door een 6 Tesla supergeleidende magneet bocht dipool in de Advanced Light Source elektron opslag ring werkend bij een kritische energie van 11,5 KeV. Een schema van het eindstation wordt getoond in Figuur 1. De x-stralen Voer het hok met een bundelgrootte van 40x ~ 4,6 mm en door het monster dat is gemonteerd op een gemotoriseerde roterende podium. Deovergebrachte x-stralen van invloed zijn op een kristal scintillator (twee materialen vaak gebruikt zijn LuAG of CdWO 4) die x-stralen om te zetten in zichtbaar licht dat wordt doorgegeven via lenzen op een CCD voor beeld collectie. De camera, scintillator en optica in een lichtdichte doos die op rails waarmee de gemengd met scintillator afstand worden geoptimaliseerd voor fase contrast beeldvorming.
Alle monsters worden aangebracht op de 10 cm diameter roterende fase die op zijn beurt gemonteerd op horizontale en verticale vertaling fasen voor monster positionering. Een levend plantenmonster, met het wortelstelsel gemonteerd in een op maat gemaakte houder plantpot en het blad in een acryl buis te zien in figuur 2. Typische blootstellingstijden kunnen variëren 0,1-1 sec met 10-18 KeV en scan lengtes variëren 5-40 min afhankelijk van de optimale instellingen voor een bepaald monster. Voor grote steekproeven (typisch van plantaardige xyleem netwerken), kunnen de gegevens scans wordenbetegelde door herhaling van de meting met het monster op verschillende hoogten, die automatisch wordt bestuurd, waardoor naadloze seriecoupes langs een maximum monsterhoogte van ~ 10 cm. Maximale sample breedte, in beeldvorming op 4,5 micrometer resolutie is ~ 1 cm voor monsters die bijna perfect in verticale richting. Genereren en verwerking voltooid met de onderstaande protocol. Vanwege het verschil in x-ray demping tussen lucht en water kunnen uitstekende beeldcontrast worden verkregen in planten zonder het gebruik van contrast oplossingen typisch medische CT systemen. De met lucht gevulde vat lumen is gemakkelijk te onderscheiden van het omringende water gevulde weefsel in gehydrateerde planten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synchrotron HRCT biedt plantenbiologen met een krachtige, niet-destructieve tool om de innerlijke werking van plantaardige vaatstelsel verkennen in ongelooflijk veel details. Deze technologie is onlangs gebruikt om niet eerder beschreven anatomische structuren in grapevine xyleem die differentieel xyleem netwerkconnectiviteit te veranderen in verschillende grapevine soorten (Brodersen et al. 2012b, in press.) Te identificeren – deze connectiviteit kan drastisch veranderen, het vermogen van vasculaire p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi, en A Zedan bedanken. Dit werk werd gefinancierd door: het Amerikaanse ministerie van Landbouw-Dienst Landbouwkundig Onderzoek Current Research Information System financiering (onderzoeksproject geen 5306-21220-004-00; De Advanced Light Source wordt ondersteund door de directeur, Office of Science, Bureau van Basic. Energy Sciences, van het Amerikaanse ministerie van Energie onder Contract No DE-AC02-05CH11231). NIFA en speciale gewassen onderzoeksinitiatief subsidie AJM.
Materials
| Material Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography. Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT). New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. , (2012).
- Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). American Journal of Botany. , (2012).
- McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem. Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).
- McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder. Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).
- Tyree, M., Sperry, J. Vulnerability of xylem to cavitation and embolism. Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).
- Tyree, M., Zimmermann, M. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. . Vascular Transport in Plants. , (2005).
- Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography. Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).
- Mannes, D., Marone, F., et al. Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research. Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).
- Maeda, E., Miyake, H. A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa. Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).
- Steppe, K., Cnudde, V., et al. Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics. Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).
- Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). Encyclopaedia Cinematographica. , (1971).
- Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels. , (2013).
- McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb. New Phytologist. 178, 719-739 (2008).
- McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography. New Phytologist. , (2012).
- Lee, K., Avondo, J., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Truernit, E., Bauby, H., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).
- Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).
- Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems. , (2010).
