שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature
Summary
רזולוצית רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת גבוהה (HRCT) היא טכניקת הדמיה לאבחון לא הרסנית שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את המבנה והתפקוד של מערכת כלי דם צמח ב-3D. אנחנו מדגימים איך HRCT מאפשר חקר של רשתות העצה על פני מגוון רחב של רקמות צמח ומינים.
Abstract
רזולוצית רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת גבוהה (HRCT) היא טכניקה שאינה הרסני אבחון הדמיה עם יכולת רזולוציה תת מיקרון שנמצא כעת בשימוש על מנת להעריך את המבנה והתפקוד של רשת עצת צמח בשלושה ממדים (3D) (לדוגמא Brodersen אח' . 2010; 2011; 2012a, ב). HRCT ההדמיה מתבססת על אותם העקרונות כמו מערכות CT רפואיות, אלא תוצאות בעצמה גבוהה synchrotron רנטגן מקור ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר וירידה בזמן רכישת תמונה. הנה, אנחנו מדגימים בפירוט כיצד סינכרוטרון מבוסס HRCT (שבוצע במקור-LBNL המתקדם אור ברקלי, קליפורניה, ארה"ב) בשילוב עם תוכנת Avizo (VSG Inc, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) נמצא בשימוש כדי לחקור את העצה בצמח נכרת רקמות וצמחי חיים. כלי הדמיה החדשים מאפשרים למשתמשים לנוע מעבר לאור מסורתי סטטי, 2D או micrographs אלקטרונים ודגימות מחקר באמצעות חלקים סדרתיים וירטואליים בכל מטוס. מספר אינסופי של פרוסות בכל האורינטציה גלהתבצע על המדגם הזהה, תכונה שאי אפשר להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה פיזית מסורתיות.
תוצאות מראות כי HRCT ניתן ליישם גם עשבוני ומיני צמחים וודי, ומגוון רחב של איברי צמח (עלים כלומר, פטוטרות, גבעולים, גזעים, שורשים). נתונים שהוצגו כאן לעזור להפגין גם מגוון של כלי דם האנטומיה צמח נציג והסוג של פירוט נשלף ממערכות HRCT, כולל סריקות לחוף סקויה (Sequoia sempervirens), אגוז (Juglans spp.), אלון (Quercus spp.), ומייפל ( Acer spp.) שתילי עצים לחמניות (Helianthus annuus), גפנים (תטיס spp.), ושרכים (Pteridium aquilinum וWoodwardia Fimbriata). דגימות שנכרתו והתייבשו ממינים עציים הן קלות ביותר לסריקה ובדרך כלל יניבו את התמונות הטובות ביותר. עם זאת, השיפורים האחרונים (כלומר סריקות מהירות יותר וייצוב מדגם) עשו את זה possניכר בו כלל להשתמש בטכניקת הדמיה זו על רקמות ירוקות (למשל פטוטרות) ובצמחים חיים. בהזדמנות כלשהי התכווצות של רקמות צמח ירוקה hydrated תגרום לתמונות המטושטשות ושיטות, כדי למנוע בעיות אלו מתוארים. ההתקדמות האחרונה האלה עם HRCT לספק תובנה חדשות ומבטיחות לתפקוד כלי דם צמח.
Introduction
מים מועברים משורשי צמח אל העלים ברקמת כלי דם נקראת עצה – רשת של צינורות המחוברים ביניהם, סיבים, ותאי חיים, פעילים מטבולית. תפקוד של תחבורת עצת מפעל חייב להישמר לאספקת חומרי מזון ומים לעלים לפוטוסינתזה, צמיחה וסופו של דבר הישרדות. הובלת מים בצינורות עצה יכולה להשתבש כאשר רשת העצה נפגעת על ידי אורגניזמים פתוגניים. בתגובה לצמחי זיהומים כאלה לעתים קרובות לייצר ג'לי, חניכיים וtyloses כאמצעי לבודד התפשטות הפתוגן (למשל McElrone et al 2008; 2010). מתח בצורת יכול גם להגביל הובלת מים בעצה. כמו צמחים מאבדים מים בצורה ממושכת, מתח בונה במוהל העצה. מים תחת מתח הוא metastable (כלומר בסף מסוים המתח יהיה גדול מספיק למער עמודות מים המצויים בצינורות עצה). לאחר cavitation מתרחש, בועת גז (תסחיף) יכולה ליצור ולמלא את המנצחuit, תנועה ביעילות חסימת מים (טיירי וSperry 1989), תופעה מקבילה למחלת דקומפרסיה (דהיינו "מתכופף") בצוללנים במעמקי ים.
למרות חשיבותו של הובלת מי עצה לתפקוד אופטימלי צמח כפי שמודגם על ידי גוף מכריע של ספרות הסטורית ועכשווית על נושא זה (וטיירי צימרמן, 2002;. הולברוק ואח', 2005), עדיין יש היבטים של רשתות העצה שנשארים חמקמק . מספר קבוצות מחקר החלו לאחרונה ניצול רזולוצית רנטגן ממוחשב גבוהה מייקר טומוגרפיה (HRCT) כדי להעריך פרטים קטנים של האנטומיה עץ ורקמת כלי דם (למשל מאיו ואח'; 2010, 2008; מהאנס ואח' 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, ב; מאדה ויקים, 2009; הערבה et al 2004).. HRCT היא טכניקה הורסת להשתמש כדי להמחיש תכונות הפנימיות של עצמים מוצקים וכדי להשיג מידע דיגיטלי על התכונות המבניות 3-D שלהם. HRCTשונה מחתול לסריקה רפואית קונבנציונלית ביכולתה לפתור את הפרטים קטנים כמו מיקרון בגודל, גם לאובייקטים בצפיפות גבוה. התקדמות בטכנולוגית HRCT סינכרוטרון שפרה רזולוציית תמונה ויחס אות לרעש במידה מספקת כך שרשתות כלי צמחים וחיבורי intervessel יכולים להיות חזותיות, הוקצתה קואורדינטות 3D, וייצא לסימולציות מודל הידראוליות. Brodersen et al. (2011) לאחרונה התקדם בטכניקה זו על ידי שילוב של 3D שחזורים שנוצרו על ידי סינכרוטרון HRCT עם מודל פורטרן שמחלצת נתונים באופן אוטומטי מרשת העצה ברזולוציה גבוהה הרבה יותר מאשר היה אי פעם אפשרי עם שיטות מסורתיות (כלומר אנטומיים סידורי חתך עם microtome וצילום תמונה במיקרוסקופ אור, למשל 1971 צימרמן). עבודה זו שמשה גם כדי לייעל מודלים הידראוליים של מערכת העצה וזיהתה מאפיינים ייחודיים של תחבורה (זרימה הפוכה כלומר יש בחלקssels בתקופות של שיא דיות) (Lee et al., בסקירה).
Synchrotron HRCT כעת ניתן להשתמש כדי להמחיש פונקציונלי עצה, רגישות לcavitation, ויכולת של צמחים לתיקון תעלות אמבוליזציה. אי ספיקה להקים מחדש בתעלות אמבוליזציה מפחיתה את היכולת הידראולית, פוטוסינתזת גבולות, ותוצאות במות צמח במקרים קיצוניים (מקדואל et al. שנת 2008). צמחים יכולים להתמודד עם תסחיפים על ידי הטיית מים סביב חסימות באמצעות בורות תעלות המקשרות פונקציונליות סמוכות, ועל ידי גידול העצה חדשה שתחליף קיבולת הידראולית לאיבוד. צמחים מסוימים יש היכולת לתקן הפסקות בעמודות המים, אבל את הפרטים של התהליך הזה בעצה תחת מתח נשארו לא ברורים במשך עשרות שנים. Brodersen et al. (2010) ולאחרונה דמיין לכמת תהליך המילוי בגפנים חיות באמצעות HRCT. כלי מוצלח למילוי היה תלוי בזרם מים מתאי חיים המקיפים את xylem תעלות, שבו טיפי מים בודדות התרחבו לאורך זמן, כולים מלאים, ואלצו את פירוק הגז לכוד. הקיבולת של צמחים שונים לתיקון כולים פרוצים עצה ומנגנוני שליטת תיקונים אלה נחקרת כעת.
תיאור של מתקן ALS Beamline 8.3.2
העבודה שלנו עד כה נערכה על ה-X-Micro טומוגרפיה Beamline הקשיח 8.3.2 במקור האור המתקדם בלורנס ברקלי הלאומית (ברקלי קליפורניה ארה"ב). דגימות צמחים מונחות בכלוב 20 מ 'עופרת מרופדת הממוקם ממקור רנטגן, שנוצר על ידי מגנט 6 טסלה מוליכי עיקול דיפול בתוך ההפעלה המתקדמת מקור אור אלקטרוני אחסון הטבעת באנרגיה קריטית של 11.5 קאב. סכמטי של תחנת הקצה מוצג באיור 1. את קרן ה-X להיכנס לכלוב עם גודל קרן של 40X ~ 4.6 מ"מ ועוברת דרך הדגימה שהוא רכובה על במה מסתובבת ממונעת.המשודר רנטגן לפגוע בscintillator גביש (שני חומרים נפוצים הם LuAG או CdWO 4) אשר להמיר בקרן רנטגן לאור הנראה שמועבר דרך עדשות על CCD לאוסף תמונה. המצלמה, אופטיקה וscintillator כלולים בתיבה הדוקה אור שהיא על מסילה שמאפשרת את מרחק מדגם לscintillator להיות מותאם להדמיה לעומת שלב.
כל הדגימות הם רכובים על במת 10 סנטימטרי הקוטר הסיבובית אשר בתורו הוא רכובה על שלבי תרגום אופקיים ואנכיים למיצוב מדגם. מדגם צמח חי, עם מערכת השורשים רכובות בבעל מותאם אישית נבנה עציץ והעלווה הכלולה בצינור אקרילי, ניתן לראות באיור 2. זמני חשיפה אופייניים יכולים לנוע 0.1-1 שניות באמצעות 10-18 קאב, ומשך סריקה ינוע 5-40 דקות בהתאם להגדרות המותאמות למדגם מסוים. לקבלת דוגמיות גבוהה (אופייני לרשתות העצה צמחים), סריקות נתונים יכולות להיותרעפים על ידי חזרה על המדידה במדגם בגבהים שונים, הנשלט באופן אוטומטי, מה שמאפשר סעיפים סידוריים חלקים לאורך גובה דגימה מרבית של ~ 10 סנטימטר. רוחב דגימה מרבי כאשר הדמיה ברזולוציה של 4.5 מיקרומטר היא ~ 1 סנטימטר לדגימות שנמצאות כמעט מושלמים בכיוון אנכי. דור ועיבוד נתונים הושלם באמצעות הפרוטוקול המפורט להלן. בגלל ההבדל בהנחתת רנטגן בין האוויר ומים, לעומת זאת תמונה מעולה ניתן להשיג בצמחים ללא שימוש בפתרוני ניגודיות טיפוסיים של מערכות רפואיות CT. לומן כלי מלא אוויר הוא להבחין בקלות מהרקמה שמסביב מלאת מים בצמחי hydrated.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synchotron HRCT מספק ביולוגי צמח עם כלי רב עצמה, שאינו הרסני לחקור את המבנה הפנימי של כלי דם צמח בפירוט מדהים. טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש לאחרונה כדי לזהות מבנים אנטומיים יתוארו בטפסים בעבר בעצת גפן דיפרנציאלי משנים את הקישוריות לרשת עצה במינים שונים גפנים (Brodersen אח' 201…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לS Castorani, AJ Eustis, GA גמבטה, CM Manuck, Z Nasafi, וZedan. עבודה זו מומנה על ידי: המחלקה למימון מחקר חקלאי חקלאות-שירות הנוכחי מחקר מידע המערכת בארה"ב (פרויקט מחקר לא 5306-21220-004-00; מקור האור המתקדם נתמך על ידי המנהל, משרד המדע, משרד בסיסי. מדעי אנרגיה, של משרד אנרגיה של ארה"ב תחת חוזה מס DE-AC02-05CH11231);. וNIFA מיוחד יבולי מחקר יוזמת המענק לAJM.
Materials
| Material Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography. Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT). New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. , (2012).
- Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). American Journal of Botany. , (2012).
- McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem. Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).
- McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder. Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).
- Tyree, M., Sperry, J. Vulnerability of xylem to cavitation and embolism. Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).
- Tyree, M., Zimmermann, M. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. . Vascular Transport in Plants. , (2005).
- Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography. Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).
- Mannes, D., Marone, F., et al. Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research. Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).
- Maeda, E., Miyake, H. A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa. Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).
- Steppe, K., Cnudde, V., et al. Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics. Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).
- Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). Encyclopaedia Cinematographica. , (1971).
- Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels. , (2013).
- McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb. New Phytologist. 178, 719-739 (2008).
- McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography. New Phytologist. , (2012).
- Lee, K., Avondo, J., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Truernit, E., Bauby, H., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).
- Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).
- Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems. , (2010).
